A Monte Whole<em> In Situ</em> Método de hibridação para o molusco gastrópode<em> stagnalis Lymnaea</em
Summary
The goal of this protocol is to provide users with a set of methods for the high-throughput decapsulation of Lymnaea stagnalis embryos and larvae in preparation for whole mount in situ hybridization, and for subsequent pre- and post-hybridization treatments.
Abstract
Montagem inteira de hibridização in situ (WMISH) é uma técnica que permite a resolução espacial das moléculas de ácidos nucleicos (ARNs mensageiros) muitas vezes dentro de uma preparação de tecido 'todo de montagem ", ou fase de desenvolvimento (tais como um embrião ou larva) de interesse. WMISH é extremamente poderoso, pois pode contribuir significativamente para a caracterização funcional de genomas metazoários complexos, um desafio que está se tornando mais um gargalo com o dilúvio de dados de sequências de próxima geração. Apesar da simplicidade conceptual da técnica muito tempo é muitas vezes necessária para optimizar os vários parâmetros inerentes às experiências WMISH para novos sistemas de modelo; diferenças subtis nas propriedades celulares e bioquímicas entre tipos de tecidos e estágios de desenvolvimento significa que um único método WMISH pode não ser apropriada para todas as situações. Temos desenvolvido um conjunto de métodos WMISH para o modelo de gastrópode Lymnaea stagnalis reemergentes que geram consistente esinais WMISH claras para uma variedade de genes, e em todos os estágios de desenvolvimento. Estes métodos incluem a atribuição de larvas de idade cronológica desconhecido para uma janela ontogênica, a remoção eficaz dos embriões e larvas das suas cápsulas de ovos, a aplicação de um tratamento de proteinase-K apropriado para cada janela ontogênica, e hibridação, de pós-hibridação e imunodetecção passos. Estes métodos proporcionam uma base a partir da qual o sinal resultante para um dado transcrito de ARN pode ser adicionalmente refinado com ajustes específicos de sonda (sonda principalmente a concentração e a temperatura de hibridação).
Introduction
Os moluscos são um grupo de animais que mantêm o interesse de uma ampla diversidade de disciplinas científicas. Apesar da sua diversidade morfológica 1, riqueza de espécies (perdendo apenas para os artrópodes em termos de número de espécies 2) e relevância para uma ampla gama de comerciais 3, médicos e científicos 4 questões 5-8, há relativamente poucas espécies de moluscos que podem reivindicar a ser ambos os modelos científicos bem equipados e fácil de manter em um ambiente de laboratório. Um molusco que é muito usado por disciplinas como a neurobiologia 9, ecotoxicologia 10 e, mais recentemente, a biologia evolutiva 11,12, é Lymnaea stagnalis, principalmente devido à sua ampla distribuição e extrema facilidade de manutenção. Apesar de sua popularidade como um organismo "modelo" e sua longa história de uso por biólogos do desenvolvimento 13-19, o alcance e poder de ferramentas moleculares disponíveis para a L. stagnalis comunidade científica encontra-se muito atrás da de modelos mais tradicionais de origem animal (Drosophila, rato, ouriço do mar, nemátodos).
O nosso desejo de desenvolver Lymnaea como um modelo molecular surge do interesse nos mecanismos moleculares que orientam a formação de shell. Isso nos motivou a refinar um conjunto de técnicas que permitam a visualização eficiente, consistente e sensível da expressão de genes durante o desenvolvimento de Lymnaea. Montagem inteira de hibridização in situ (WMISH) é amplamente utilizado para uma variedade de organismos-modelo e tem sido usado por mais de 40 anos 20. Nas suas diferentes formas, ISH pode ser empregue para localizar espacialmente loci específicos nos cromossomas, ARNr, ARNm e micro-ARN.
Um dos desafios que precisávamos para resolver antes da refinação um método WMISH para L. stagnalis foi a questão do cuidado e de forma eficiente extração embriões e larvas de diferentes estágios de tele cápsulas de ovos em que são depositadas. Esta extracção, ou 'desencapsulamento', tem de ser conseguida de forma eficiente, a fim de recolher o material adequado para uma determinada experiência in situ, enquanto, ao mesmo tempo mantendo a integridade morfológica e celular. Enquanto outros organismos modelo também submetidos a um desenvolvimento encapsulado, em nossas mãos nenhum dos métodos descritos para as espécies poderia ser empregada com sucesso em L. stagnalis.
Os objetivos gerais deste método são, portanto: para extrair L. stagnalis embriões e larvas de suas cápsulas em uma forma de alto rendimento, para aplicar tratamentos pré-hibridação que optimizam o sinal WMISH, para preparar embriões e larvas com WMISHsignals satisfatórios para a imagem latente.
Protocol
Representative Results
Discussion
O método descrito aqui permite a visualização eficiente de transcrições de RNA com presumivelmente diferentes níveis de expressão dentro de todos os estágios de desenvolvimento de Lymnaea stagnalis. Para remover embriões e larvas de suas cápsulas que trialed uma variedade de produtos químicos, choque osmótico e tratamentos físicos relatados para outra encapsulated- desenvolvimento de organismos-modelo. No entanto, nas nossas mãos o método aqui descrito, é a única técnica de alto rendimento que…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo financiamento para DJJ por meio de projeto DFG # JA2108 / 2-1.
Materials
| Featherweight forceps | Ehlert & Partner | #4181119 | |
| Silicon tubing | Glasgerätebau OCHS GmbH | 760070 | |
| Glass capillaries | Hilgenberg | 1403547 | |
| 12 well tissue culture dishes | Carl Roth | CE55.1 | |
| 37% Formaldehyde | Carl Roth | P733.1 | CAUTION – May cause cancer. Toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Toxic: danger of very serious irreversible effects through inhalation, in contact with skin and if swallowed. |
| Ethylenediamine tetraacetic acid | Carl Roth | CN06.3 | CAUTION – CAUSES EYE IRRITATION. MAY CAUSE RESPIRATORY TRACT AND SKIN IRRITATION. Avoid breathing dust. Avoid contact with eyes, skin and clothing. Use only with adequate ventilation |
| Magnesium Chloride | Carl Roth | 2189.1 | |
| Tween-20 | Carl Roth | 9127.1 | CAUTION – May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed. |
| Sodium Chloride | Carl Roth | 3957.1 | |
| Ficoll type 400 | Carl Roth | CN90.1 | |
| polyvinylpyrrolidone K30 (MW 40) | Carl Roth | 4607.1 | CAUTION – May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed. |
| Nuclease freeBovine Serum Albumin | Carl Roth | 8895.1 | |
| Salmon sperm | Carl Roth | 5434.2 | |
| Heparin | Carl Roth | 7692.1 | CAUTION – ADVERSE EFFECTS INCLUDE HEMORRHAGE, LOCAL IRRITATION. POSSIBLE ALLERGIC REACTION IF INHALED, INGESTED/CONTACTED. EYES/SKIN/RESPIRATORY TRACT IRRITANT. POSSIBLE HYPERSENSITIZATION. DURING PREGNANCY HAS BEEN REPORTED TO INCREASE RISK OF STILLBIRTH |
| Proteinase-K | Carl Roth | 7528.1 | |
| Glycine | Carl Roth | 3790.2 | |
| Deionised formamide | Carl Roth | P040.1 | CAUTION – Irritating to eyes and skin. May be harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. May cause harm to the unborn child. Hygroscopic. |
| Standard formamide | Carl Roth | 6749.3 | CAUTION – Irritating to eyes and skin. May be harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. May cause harm to the unborn child. Hygroscopic. |
| Triethanolamine | Carl Roth | 6300.1 | CAUTION – Avoid breathing vapor or mist. Avoid contact with eyes. Avoid prolonged or repeated contact with skin. Wash thoroughly after handling. |
| Acetic anhydride | Carl Roth | 4483.1 | CAUTION – CAUSES SEVERE SKIN AND EYE BURNS. REACTS VIOLENTLY WITH WATER. HARMFUL IF SWALLOWED. VAPOR IRRITATING TO THE EYES AND RESPIRATORY TRACT |
| Maleic acid | Carl Roth | K304.2 | CAUTION – Very hazardous in case of eye contact (irritant), of ingestion, . Hazardous in case of skin contact (irritant), of inhalation (lung irritant). Slightly hazardous in case of skin contact (permeator). Corrosive to eyes and skin. |
| Benzyl benzoate | Sigma | B6630-250ML | CAUTION – May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. Harmful if swallowed. |
| Benzyl alcohol | Sigma | 10,800-6 | CAUTION – Harmful if swallowed. Harmful if inhaled. Causes serious eye irritation. |
| Glycerol | Carl Roth | 3783.1 | |
| Blocking powder | Roche | 11096176001 | |
| Anti DIG Fab fragments AP conjugated | Roche | 11093274910 | |
| Tris-HCl | Carl Roth | 9090.3 | |
| 4-Nitro blue tetrazolium chloride in dimethylformamide | Carl Roth | 4421.3 | CAUTION – May cause harm to the unborn child. Harmful by inhalation and in contact with skin. Irritating to eyes. |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate | Carl Roth | A155.3 | CAUTION – Potentially harmful if ingested. Do not get on skin, in eyes, or on clothing. Potential skin and eye irritant. |
| N-acetyl cysteine | Carl Roth | 4126.1 | |
| Dithiothreitol | Carl Roth | 6908.1 | CAUTION – May cause eye and skin irritation. May cause respiratory and digestive tract irritation. The toxicological properties of this material have not been fully investigated. |
| Tergitol | Sigma | NP40S | CAUTION – May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed. |
| Sodium dodecyl sulphate | Carl Roth | CN30.3 | CAUTION – Harmful if swallowed. Toxic in contact with skin. Causes skin irritation. Causes serious eye damage. May cause respiratory irritation. |
| Potassium Chloride | Carl Roth | 6781.1 | |
| di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO4.2H2O) | Carl Roth | 4984.1 | |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Carl Roth | 3904.1 | |
| Tri sodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7.2H2O) | Carl Roth | 3580.1 | CAUTION – May cause eye, skin, and respiratory tract irritation. The toxicological properties of this material have not been fully investigated. |
| Mineral oil | Carl Roth | HP50.2 | |
| InSituPro-Vsi | Intavis | www.intavis.de/products/automated-ish-and-ihc |
Riferimenti
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