La investigación de la función de Coronin A en la temprana respuesta del hambre de<em> Dictyostelium discoideum</em> Los ensayos de agregación por
Summary
The social amoeba Dictyostelium discoideum undergoes a developmental transition into a multicellular organism when starved. The evolutionary conserved protein coronin A plays a crucial role in the initiation of development. Using aggregation assays as our main method, we aim to elucidate the role of coronin A in early development.
Abstract
Dictyostelium discoideum amebas se encuentra en el suelo, se alimentan de bacterias. Cuando las fuentes de alimentos se vuelven escasos, secretan factores de iniciar un programa de desarrollo pluricelular, durante el cual las células individuales chemotax hacia los centros de agregación 1-4. Este proceso es dependiente de la liberación de adenosina monofosfato cíclico (cAMP) 5. cAMP se produce en ondas a través de la acción concertada de la adenilato ciclasa y las fosfodiesterasas, y se une a receptores de cAMP acoplados a proteínas G 6,7. Un ensayo ampliamente utilizado para analizar los mecanismos implicados en el ciclo de desarrollo del menor eucariota Dictyostelium discoideum se basa en la observación de la agregación celular en condiciones sumergidas 8,9. Este protocolo describe el análisis de la función de coronin A en el ciclo de desarrollo por el hambre en placas de cultivo de tejidos sumergidos en solución salina equilibrada (BSS) 10. Coronin A es un miembro de la pr ampliamente conservadafamilia Otein de coronins que han sido implicados en una amplia variedad de actividades de 11,12. Dictyostelium células que carecen de Coronin A no son capaces de formar agregados multicelulares, y este defecto puede ser rescatado por el suministro de pulsos de cAMP, lo que sugiere que Coronin A actúa aguas arriba de la cAMP en cascada 10. Las técnicas descritas en estos estudios proporcionan herramientas robustas para investigar funciones de las proteínas durante las etapas iniciales del ciclo de desarrollo de Dictyostelium discoideum aguas arriba de la cascada de AMPc. Por lo tanto, la utilización de este ensayo de agregación puede permitir el estudio adicional de coronin una función y avanzar en nuestra comprensión de la biología coronin.
Introduction
La familia de proteínas coronin está altamente conservada en todo eucariotas. Estas proteínas se caracterizan por la presencia de un triptófano-aspartato amino-terminal (WD) región seguido de una región única conectado a un dominio espiral de la bobina carboxi-terminal 13,14 repetir que contienen (Figura 1). Coronins han sido implicados en una variedad de funciones celulares, incluyendo la regulación del citoesqueleto y la transducción de señales 12. En los mamíferos, hasta seis moléculas cortas coronin (coronin 1-6), así como un 'tándem' coronin 7, se pueden co-expresaron 12,15. Coronin 1 es el miembro de la familia más ampliamente estudiado y ha demostrado estar implicado en la destrucción de patógenos, la supervivencia de las células T y la señalización neuronal. ¿Cómo, exactamente, coronin 1 lleva a cabo estas actividades aún no está claro. Mientras coronin 1 se muestra para regular Ca2 + y cAMP-dependiente de señalización, así como F-actina del citoesqueleto de modulación 16-18, el potencial de co-expresión de hasta 7 miembros de la familia de los mamíferos ha hecho que sea difícil para el estudio de la función molecular de coronins en estos sistemas, debido a las posibles redundancias. A diferencia de los organismos mamíferos, la discoideum eucariota inferior Dictyostelium expresa sólo dos miembros de la familia (coronin coronin A, el ortólogo de mamífero coronin 1 y coronin B, el ortholog de mamíferos coronin 7) con funciones aparentemente no redundantes 15,19,20. Este hecho hace que Dictyostelium discoideum un modelo potente para estudiar la función de coronins.
Para estudiar el papel de coronin A en Dictyostelium discoideum, se indujo el ciclo de desarrollo por el hambre en placas de cultivo de tejidos que contienen tampón de equilibrado solución salina (BSS) utilizando ya sea células de tipo salvaje o células que carecen de Coronin A 10. Se encontró que las células que carecen coronin A no fueron capaces de formar agregados multicelulares a la inanición. Para una evaluación cuantitativa exacta de este fenotipo laimágenes de células vivas automatizado descrito en este protocolo es una herramienta vital. El defecto en la iniciación de la respuesta del hambre temprano en las células que carecen Coronin A puede ser rescatado por el suministro de pulsos de cAMP, lo que sugiere que Coronin A actúa aguas arriba de la cascada de AMPc. La aplicación exógena de pulsos de AMPc para simular el inicio del desarrollo ha sido utilizado por varios laboratorios en el pasado 8,9. Sin embargo, este procedimiento también es conocido por ser dependiente de las densidades de células y el tiempo altamente. Por lo tanto, el protocolo descrito aquí tiene como objetivo reducir estas variabilidades con el fin de garantizar un alto grado de reproducibilidad. En conjunto, las técnicas utilizadas en estos estudios proporcionan herramientas robustas para investigar funciones de las proteínas durante las primeras etapas del ciclo de desarrollo de Dictyostelium discoideum y tienen el potencial de identificar arriba, así como efectores aguas abajo de Coronin una función.
Protocol
Representative Results
Discussion
Las proteínas Coronin se encuentran en la mayoría taxones del clado eucariota. Dictyostelium discoideum coronin A, el homólogo de coronin de mamíferos 1, está implicado en la respuesta del hambre temprano, ya Coronin A-deficiente células no son capaces de formar centros de agregación durante el temprano desarrollo ciclo de 10. Para poder evaluar cuantitativamente y con precisión el retraso en el desarrollo entre las cepas, un microscopio de imágenes de células vivas puesta a punto con el co…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the Dictyostelium Stock Center for strains and reagents. This study was financed by grants from the Swiss National Science Foundation and the Canton of Basel.
Materials
| HL-5 media (for 1L: 5 g proteose peptone, 5 g thiotone E peptone, 10 g glucose, 5 g yeast extract, 0.35 g Na2HPO4∗2H2O, 0.35 g KH2PO4, 0.05 g dihydrostreptomycin-sulfate, pH 6.6) | |||
| Proteose peptone | BD Bioscience | 211693 | |
| Thiotone E peptone | BD Bioscience | 211684 | |
| Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
| Glucose | AppliChem | A3666 | |
| Na2HPO4∗2H2O | Fluka | 71643 | |
| KH2PO4 | AppliChem | A1043 | |
| dihydrostreptomycin-sulfate | Sigma-Aldrich | D1954000 | |
| PBM (0.02 M potassium phosphate, 10 μM CaCl2, and l mM MgCl2, pH 6.1) | self made | ||
| BSS (10 mM NaCl, 10 mM KCl, 2.5 mM CaCl2, pH 6.5) | self made | ||
| 0.45-μm Filtropure S filter | Sarstedt | 83.1826 | |
| Falcon 24-well Tissue culture plate | Fisher Scientific | 08-772-1H | |
| Cellobserver microscope | Zeiss | custom built | |
| AxioVision software | Zeiss | ||
| IPC Microprocessor–controlled dispensing pump | ISMATEC | ISM 931 | |
| Axiovert 135M microscope | Zeiss | 491237-0001-000 | |
| Incubation Shaker | Inforst HT Minitron |
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