तरीके तंतुकोशिका प्रवासन के नियमन में Mrp4 युक्त macromolecular परिसर अध्ययन करने के लिए
Summary
MRP4 सेल प्रवास में एक हाल ही में स्पष्ट भूमिका सहित विभिन्न चक्रीय न्यूक्लियोटाइड निर्भर संकेत घटनाओं को नियंत्रित करता है। हम एक अद्वितीय MRP4 interactome कि fibroblast प्रवास के ठीक-देखते विनियमन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है की पहचान में जिसके परिणामस्वरूप MRP4 के बहाव के आणविक लक्ष्यों को जानने के लिए एक सीधा, लेकिन बहुमुखी दृष्टिकोण का वर्णन है।
Abstract
बहुऔषध प्रतिरोध प्रोटीन 4 (MRP4) झिल्ली ट्रांसपोर्टरों की एटीपी बाध्यकारी कैसेट परिवार का एक सदस्य है और चक्रीय न्यूक्लियोटाइड की एक अंतर्जात तपका ट्रांसपोर्टर है। intracellular चक्रीय न्यूक्लियोटाइड एकाग्रता नियमन करके, MRP4 सेल प्रवास सहित कई चक्रीय न्यूक्लियोटाइड निर्भर सेलुलर घटनाओं को नियंत्रित कर सकते। इससे पहले, हम दिखा दिया है कि MRP4 के अभाव में, fibroblast कोशिकाओं intracellular चक्रीय न्यूक्लियोटाइड के उच्च स्तर होते हैं और तेजी से पलायन कर सकते हैं। इस खोज के अंतर्निहित तंत्र को समझने के लिए, हम एक सीधा अभी तक बहुमुखी दृष्टिकोण अपनाया। सबसे पहले, हम बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा पीछा immunoprecipitation का उपयोग कर एक MRP4 अधिक अभिव्यक्ति सेल प्रणाली से संभावित MRP4 की बातचीत प्रोटीन परिसरों को अलग किया। MRP4 interactome में अद्वितीय प्रोटीन की पहचान करने के बाद, हम सरलता मार्ग विश्लेषण (आईपीए) के लिए उपयोग संकेत पारगमन के संदर्भ में इन प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत की भूमिका का पता लगाने के लिए। हम पुलिस elucidatedसेल प्रवास में MRP4 प्रोटीन जटिल और सेल प्रवास पर MRP4 के प्रभाव का एक प्रमुख मध्यस्थ के रूप में पहचान एफ actin की क्षमता का भूमिका। इस अध्ययन में यह भी प्रवासी घटना में प्रमुख खिलाड़ी के रूप शिविर और cGMP की भूमिका पर बल दिया। उच्च सामग्री माइक्रोस्कोपी का उपयोग करना, हम सेल प्रवास assays प्रदर्शन किया है और कहा है कि fibroblast प्रवास पर MRP4 का असर पूरी तरह से actin cytoskeleton या शिविर पर निर्भर काइनेज ए (PKA) के निषेध के विघटन से समाप्त कर दिया है। वास्तविक समय में एक पलायन सेल में modulations संकेत कल्पना करने के लिए, हम PKA गतिविधि को मापने के लिए एक झल्लाहट आधारित सेंसर का उपयोग किया और पाया, की Mrp4 पलायन अग्रणी धार के पास अधिक ध्रुवीकृत PKA गतिविधि की उपस्थिति – / – fibroblast, की तुलना में Mrp4 + / fibroblasts +। यह बदले में cortical actin गठन वृद्धि हुई है और प्रवास की प्रक्रिया संवर्धित। हमारा दृष्टिकोण प्रोटीन MRP4 के बहाव के अभिनय की पहचान के लिए सक्षम बनाता है और एक से अधिक के साथ हमें प्रदान करता हैfibroblast प्रवास के MRP4 निर्भर विनियमन में शामिल तंत्र का दृश्य।
Introduction
सेल प्रवास एक जटिल बहु कदम प्रक्रिया है। अध्ययनों से पता चला है कि प्रवास के दौरान कोशिकाओं के प्रमुख और अनुगामी किनारों में ध्रुवीकरण कर रहे हैं। बाह्य मैट्रिक्स का पालन करके, अग्रणी धार सेल शरीर को आगे ले जाने के लिए आवश्यक कर्षण प्रदान करता है। अंत में, अनुगामी किनारे विज्ञप्ति पीछे संलग्नक और प्रवास चक्र 1,2 पूरा करती है।
कुशल सेल प्रवास के लिए सेल ध्रुवीकरण intracellular संकेतन के स्थानिक अलगाव द्वारा विनियमित है। इस तरह के शिविर के रूप में सेलुलर दूसरा दूत, ठीक-देखते दिशात्मक सेल प्रवास 3,4 के लिए आवश्यक संकेत घटनाओं के compartmentalization मध्यस्थता। अग्रणी धार पर शिविर और शिविर पर निर्भर काइनेज PKA गतिविधि के तरजीही राशि दिशात्मक सेल प्रवास 5,6 में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। ऐसे रास संबंधी सी 3 बोटुलिनम टॉक्सिन सब्सट्रेट (आरएसी) और कोशिका विभाजन नियंत्रण प्रोटीन 42 Homolog या Cdc42, पी के रूप में छोटे GTPases phosphorylating द्वाराएक अग्रणी धार पर actin से संबंधित प्रोटीन 2/3 (एआरपी 2/3) को सक्रिय करता है और lamellipodia 7-9 के गठन लाती है। PKA भी एक विरोधी कैपिंग एजेंट phosphorylates, vasodilator phosphoprotein (वीएएसपी) को प्रेरित किया, जिससे झिल्ली विस्तार और त्याग 10,11 के oscillatory चक्र को नियंत्रित करता है।
झिल्ली ही सीमित तपका ट्रांसपोर्टरों 3 से adenylate साइक्लेज, द्वितीय) phosphodiesterases द्वारा क्षरण और iii) परिवहन द्वारा i) संश्लेषण: कोशिकाओं में, शिविर के स्तर के तीन प्रमुख प्रक्रियाओं द्वारा विनियमित रहे हैं। बहुऔषध प्रतिरोध प्रोटीन 4 (MRP4), चक्रीय न्यूक्लियोटाइड की एक अंतर्जात तपका ट्रांसपोर्टर के रूप में एटीपी बाध्यकारी कैसेट (एबीसी) झिल्ली ट्रांसपोर्टरों, कार्यों के परिवार के एक सदस्य है। इसलिए, MRP4 intracellular शिविर के स्तर को विनियमित कर सकते हैं और शिविर पर निर्भर सेलुलर 11-13 संकेत है। हम पहले से पता चला है कि Mrp4 में – / -, fibroblasts चक्रीय न्यूक्लियोटाइड के अपेक्षाकृत उच्च स्तर होते हैं और पलायन तेजी से गMrp4 + + / fibroblasts से 14 ompared। हम यह भी fibroblast प्रवास पर चक्रीय न्यूक्लियोटाइड की एक biphasic प्रभाव की सूचना दी। पिछले अध्ययनों के आधार पर और हमारी खोज है कि Mrp4 – / – fibroblasts प्रवास के दौरान अधिक ध्रुवीकृत शिविर में होते हैं, हम धारणा है कि fibroblast पलायन के इस MRP4 की मध्यस्थता नियमन शिविर निर्भर है। आदेश के बहाव के तंत्र को समझने के लिए, हम एक प्रत्यक्ष अभी तक बहुमुखी दृष्टिकोण ले लिया।
जुड़ा हुआ है और MRP4 के साथ परस्पर क्रिया में प्रोटीन की पहचान करने के लिए, हम HEK293 कोशिकाओं पर MRP4 व्यक्त करते हैं कि MRP4 से युक्त macromolecular परिसर immunoprecipitated। जन स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग करना, हम कई MRP4-बातचीत प्रोटीन की पहचान की और सरलता मार्ग विश्लेषण (आईपीए) का उपयोग कर अपने इंटरकनेक्टिविटी का विश्लेषण किया। आईपीए प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत (दोनों संरचनात्मक और कार्यात्मक) का विश्लेषण और विशेष रूप से शारीरिक और रोग में उनके योगदान का पता लगाने के लिए एक उपयोगी उपकरण हैसाहित्य और प्रयोगात्मक सबूत के आधार पर 15,16 घटनाओं। आईपीए संकेत दिया एफ actin सेल प्रवास के संदर्भ में MRP4 का एक प्रमुख लक्ष्य नीचे की ओर है कि जहां शिविर और cGMP अणुओं 17 सिगनल महत्वपूर्ण हैं। इन आंकड़ों से आगे उच्च सामग्री माइक्रोस्कोपी द्वारा पुष्टि की गई। उच्च सामग्री माइक्रोस्कोपी पर कब्जा है और एक और अधिक सुविधाजनक सटीक और उच्च throughput ढंग से 18 में इस तरह के सेल प्रवास के रूप में सेल व्यवहार का विश्लेषण कर सकते हैं। उच्च सामग्री माइक्रोस्कोपी डेटा दिखा दिया है कि fibroblast प्रवास पर MRP4 का असर पूरी तरह से actin cytoskeleton या PKA 17 के निषेध के विघटन पर समाप्त कर दिया है।
इसके अतिरिक्त, हम एक Förster प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट) आधारित PKA सेंसर वास्तविक समय में कोशिकाओं पलायन में PKA गतिशीलता की निगरानी के लिए इस्तेमाल किया। झल्लाहट आधारित काइनेज सेंसर आमतौर पर विशिष्ट फोस्फोराइलेशन सब्सट्रेट सीएफपी और YFP fluorophores 19-21 से घिरे पेप्टाइड्स से मिलकर बनता है। pmAKAR3 एक सुधार हुआ है और मैं हूँmbrane लक्षित झल्लाहट आधारित PKA सेंसर कि forkhead जुड़े डोमेन 1 (FHA1) और PKA सब्सट्रेट अनुक्रम LRRATLVD 5,22 शामिल हैं। PKA उत्प्रेरक सबयूनिट बढ़ द्वारा pmAKAR3 के फोस्फोराइलेशन सीएफपी और YFP 19 के बीच संकेत झल्लाहट। सेंसर में एक लिपिड संशोधन डोमेन की प्रविष्टि PKA गतिशीलता की निगरानी, विशेष रूप से झिल्ली डिब्बे 23 के लिए प्लाज्मा झिल्ली को यह लक्ष्य।
PmAKAR3 उपयोग करना, हम दिखा दिया है कि Mrp4 पलायन के अग्रणी धार – / – Mrp4 + + / fibroblasts, जो बारी में सेल के अग्रणी बढ़त 17 में cortical actin गठन वृद्धि की तुलना में अधिक ध्रुवीकृत PKA गतिविधि का प्रदर्शन किया fibroblasts। साथ में, इन घटनाओं के लिए बेहतर सेलुलर ध्रुवीकरण और MRP4 के अभाव में तेजी से दिशात्मक सेल प्रवास में हुई। हमारे विशेष और प्रत्यक्ष दृष्टिकोण MRP4 के लिए कुंजी नीचे की ओर लक्ष्यों की पहचान की है और एक महत्वपूर्ण प्रदान करता है, लेकिन के रूप मेंfibroblast प्रवास के MRP4 निर्भर विनियमन के लिए अभी तक बेरोज़गार तंत्र।
Protocol
Representative Results
Discussion
Cell migration is an intricate process that plays indispensable roles in many important physiological events including wound healing1,2. Aberrant cell migrations may cause catastrophic events, such as tumor metastasis and angiogenesis24,25. Therefore, fine-tuned regulation of cell migration is required to maintain normal body function.
Using high-content microscopy18, we demonstrated that MRP4-deficient MEFs migrate faster compared to wild-type fibroblasts…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Institutes of Health grants R01-DK080834 and R01-DK093045. We thank J. Denise Wetzel, CCHMC Medical Writer, for editing of the manuscript.
Materials
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen(Carlsbad, CA) | 11668-027 | |
| DMEM | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 11965-092 | |
| IncuCyte Zoom | Essen BioScience | ||
| 96-well IncuCyte Image-Lock microplates | Essen BioScience | 4493 | |
| Latrunculin B | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). | L5288 | Stock in DMSO |
| H-89 | Enzo Life Sciences (Farmingdale, NY) | BML-EI196 | Stock in DMSO |
| 35-mm glass-bottomed dishes | (MatTek Corporation; Ashland, MA) | P35G-1.5-20-C | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). | F1141 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Media | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 31985-088 | |
| FRET microscopy system | Olympus inverted microscope (IX51) | ||
| CCD camera | Hamamatsu, Japan | ORCA285 | |
| SlideBook software 5.5 | Intelligent Imaging Innovation ( Denver, CO) | ||
| Ingenuity Pathway Analysis software | IPA, QIAGEN Redwood City, | ||
| Forskolin | Tocris (Ellisville, MO). | 1099 | Stock in100% EtOH |
| DMEM F-12 | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 11330-057 | |
| HBSS | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 14025-134 | |
| Excel | Microsoft | ||
| PBS | Invitrogen(Carlsbad, CA) | 10010-023 | |
| Trypsin/EDTA Solution (TE) | Invitrogen(Carlsbad, CA) | R-001-100 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen(Carlsbad, CA) | 15140-122 |
Riferimenti
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