Quantification of cardiomyocyte turnover is challenging. The protocol described here makes an important contribution to this challenge by enabling accurate and sensitive quantification of neo-cardiomyocyte nuclei generation and nuclei ploidy.
그것은 심장이 정상적인 노화 동안 부상에 따라 심근 및 심근 매출의 낮은 수준의 발생을 재생하는 제한된 잠재력을 가지고 있음을 인정하고 있지만, 이러한 이벤트의 정량화 도전 남아 있습니다. 이는 공정의 희귀 성 및 다중 셀룰러 소스 심근 유지에 기여한다는 사실에 부분적으로있다. 또한, 심근 세포 내에서 DNA 복제는 종종 배수체 심근로 연결 만 거의 세포 분열에 의해 새로운 심근 세포로 연결합니다. 정확하게 이러한 프로세스 사이에 심근 매출 차별을 정량화하기 위해 필수적이다. 여기에 설명 된 프로토콜은 핵 분리 및 후속 PCM1의 immunolabeling를 이용하여 식별 DNA 복제 및 심근 핵의 결과로서 생겨 모든 핵 라벨 위해 장기 클레오 표지를 사용한다. 함께이 (C)의 뉴 클레오 사이드 라벨의 정확하고 민감한 식별을 허용핵 인구 ardiomyocyte. 또한, 4 ', 6-diamidino-2-페닐 인돌 라벨 및 핵 배수성의 분석은 배체 동안 뉴 클레오 시드 통합 한 핵에서 신 심근 핵의 차별을 할 수 있습니다. 이 방법은 심근 binucleation를 통제 할 수는 없지만 배체를 차지하면서, 그것은 신 심근 핵의 신속하고 강력한 정량화 할 수 있습니다. 이 방법은 심근의 재생을 향상시키는 잠재력을 평가 치료제 또는 심근 회전율 및 배수성에 심장 질환의 효과를 조사하고 포함 하류 다수의 애플리케이션을 갖는다. 이 기술은 모든 심장 세포 유형에서 뉴 클레오 사이드 혼입의 정량화를 허용 추가적인 하류 면역 조직 기술과 호환된다.
최근 몇 년 동안 심장은 말기 차별화 된 후 유사 분열 장기 1,2 있다는 상상에 도전하는 증거가 축적되고있다. 그러나, 심근 매출 및 재생의 정량화 도전 남아 있습니다.
정확하게 표준 면역 조직 화학 기술을 사용하여 희귀 심근 세대를 식별의 어려움을 잘 3을보고됩니다. 또한, 심근 세대의 세포 소스는 심근의 증식에 의해뿐만 아니라 줄기 세포 분화 4-6으로 기여 증거가 불확실하다. 따라서, 심근 전구 표현형의 지식을 필요로 혈통 추적 모델의 사용이 불가능하고 심근을 포함하는 단일 인구의 확산의 정량화하고, 부적절한. 더욱이 심근가 karyokinesis없이 endoreplication에 대한 잠재력을 가지고있다 (A 배수체 차 결과diomyocyte) 또는 세포질 분열의 (a 이핵 심근의 결과로) 7,8의 부재에서 karyokinesis. 심근 매출의 정확한 정량이 이벤트와 진정한 신 심근 세대를 구별 할 수있는 능력에 달려있다. 심근 세포의 DNA 복제 및 사이클린 의존적 인산화 효소의 발현이 독점적으로 진정한 세포 분열 9,10을 입증하지 않기 때문에이 독특한 합병증을 만듭니다.
장기의 새로운 방법에 의해 버그만 등. 7,11 바와 같이 신 심근 세대의 정량을 지원하기 위해 설립 된 핵 분리 기술 및 심근 핵 식별을위한 pericentriolar 재료 (1) (PCM1)의 면역 라벨을 결합했다 DNA 라벨 및 배수성 분석. PCM-1은 차별화, 비 사이클링 근육 세포의 핵 표면에 축적 중심체 단백질이다. 이전의 연구에 대한 항체 것을 증명하고있다PCM-1은 특히 심근 핵 7,11 라벨 등 PCM1 독립적 그룹들에 의해 사용 된 바와 같이 심근 1,12,13의 동정을 행 하였다. 또한, 우리는 PCM1 표현은 TNT-CRE 형질 전환 마우스 모델 (14) (보충 그림 1)에서 유전자 표지 심근 핵에 매핑 있음을 증명하고있다.
여기에 설명 된 프로토콜에 관계없이 의한 분석 (도 1C 및 D)에서 배체 셀룰러 기원 (도 1A 및 B)를 동시에 클레오 라벨을 제외한 상태에서의 마우스 심장 네오 심근 핵 생성의 정확하고 민감한 식별을 가능하게한다. 이 방법은 심근 binucleation에 대해 제어 할 수 있지만, 심근 매출의 정확한 정량에 필요한 신 심근 핵의 신속하고 강력한 정량화 할 수 있습니다. 더욱이,그것은 심근 세대의 역학의 잠재적 변화를 평가하기위한 신속한 검사 도구를 제공합니다.
DNA 라벨링 일반적 티미 딘 유사체로서 5- 브로 모 -2'- 데 옥시 우리 딘 (BrdU의)을 포함하지만, 여기에 설명 된 프로토콜은보다 신속한 대한 적은 처리 단계를 필요로 5-에 티닐 -2'- 데 옥시 우리 딘 (EDU) 기반 분석을 사용하여 스루 – 넣고 다른 면역 염색 프로토콜과 그에있어서의 전위 하류 어플리케이션 증가와 호환 제작, 면역 검출 용 DNA의 변성 필요로하지 않는다.
그림 1 : 에듀와 연속 펄스에 관계없이 자신의 조상의 신 심근 레이블. (A)는 EDU 세포 분열 동안 심근 세포의 DNA에 혼입된다. 심근 인구의 확산이 있습니다 END_STRONG_1합니다심근의 증가, 또는 교체에 t 및 따라서 생산적인 DNA 합성이 (조직 유지 보수 및 수리에 기여)입니다. (B)는 EDU 세포 분열 동안 심장 전구 세포의 DNA에 혼입된다. 이는 심근 계보로 분화하는 동안 셀에 유지됩니다. 이것은 줄기 세포의 분화는 심근 세포의 수가 증가를 초래하기 때문에 조직의 유지 보수에 기여한다. (C) 심근 세포가 심근 비대증 심근 개조와 관련된 증가 심근 배수성, 결과적으로 "비 제조"DNA 복제를 겪게 할 가능성이 있지만, 손실 된 심근 세포를 대체하지 않는다. 그것은 두 개의 상동 염색체 (> 2N)의 네 개 이상의 세트들을 포함하는 하나의 핵을 가진 심근 결과로서 배체하는 과정 binucleation 다르다. 연속 핵 P는 다음 (D)ulse,이 프로토콜은 심근 배수성 및 에듀 법인 모두의 정량화 할 수 있도록 PCM1 식에 의한 심근 핵의 핵 분리 및 식별을 설명합니다. PCM1의 표현과 유동 세포 계측법하여 검출 듀 설립. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
정확하게 심근 매출을 정량화하고 재생 분석은 진정한 심근 생성 및 비생산적인 DNA 부문을 구분해야합니다. 많은 연구에만 사이클린 운동성 및 세포주기 마커의 발현을 통해 심근 증식을 정량화, 단순히 이러한 비생산적인 이벤트를 무시하고 계속합니다. 이러한 비생산적인 이벤트를 제어하는 암시 남아있는 동안 심근 매출의 정확한 정량을 할 수있는 하나의 방법 날짜합니다. 특히 이는 심근 DNA 복제의 13 ~ 65 %가되도록 기여 심근 배체를 고려하는 것이 곤란 남아있다. 따라서 심근 발생의 정확한 정량 우리가 증가 배수성 결과 DNA 복제를 배제하면서 네오 심근 핵의 비율의 강력한 정량을 가능하게하는 프로토콜을 개발 지원하기. 비록이 프로토콜 할 수있는 신 심근 장군 사이하지 차별기 및 심근 이중 핵, 그것은 신속 정확하게 사용 상한 심근 세대 (배수성 차지)를 계산할 수있다. 이 프로토콜은 따라서 질병 모델에서 심근 생성 및 배체의 비율의 잠재적 변화를 평가하기 위해 또는 치료제의 잠재적 효율성을 평가하기 위해 선별 도구를 제공합니다. 네오 심근 핵 생성 속도의 변경이 프로토콜을 이용하여 확인되면 심근 핵 번호 심근 세대의 변화에 의한이 이전 2,13,17,18 바와 같이하면 후속 연구를 확인하는데 사용될 수있다. 이 펄스 기간 동안 조직 학적 정량 심근 핵 역학의 사용을 포함하거나의 단핵 및 다핵 심근 개체수 듀 혼입 비교 듀 펄스 동물로부터 얻은 조직 절편의 분석.
때문에 심근 회전율이 낮은 수준프로토콜은 7 일 동안 EDU 여러 주사를 사용한다. 이것은 또한이 심근 세대 셀룰러 모든 잠재적 소스 "쫓는"이 기간 동안 누적 심근 핵 생성의 정량화를 허용 할 수 있습니다. 연구에 따라,이 기간은 심근 생성의 예측 수치에 맞게 조정될 수있다. 심근 핵에 듀 혼입의 정확한 정량화를 들어, PCM-1 반응성을 검출하는 데 사용되는 이차 항체로 핵에는 비 특정 표시가없는 것이 필수적이다. 따라서, 그 이외의 이차 항체가이 프로토콜이 사용되는 경우에 특히 제안 된 프로토콜의 이러한 측면을 최적화하기 위하여 추가 이차 항체 적정 실험을 수행하기 위해 신중하다. 여기에 설명 된 프로토콜은 심근 핵을 식별 PCM-1의 발현을 사용한다. 이 확립 된 심근 세포 마커 인 반면, 다른 마커 확인하는데 사용될 수있다데이터; 이 부분적으로 심근 핵 1에서 지역화로 확인 된 심장 트로포 닌 T에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 마찬가지로, 다른 핵 단백질은 국소 심근 이외 핵 집단에 듀 혼입를 식별하고 정량화하기 위해 사용될 수있다. 이 DNA 합성의 운명을 알 및 세포 분열 또는 증가 배수성 하나 될 수 있으므로 적극적 유사 분열을 겪고있는 모든 심근 핵은 분석에서 제외하는 것이 중요하다. PCM1 따라서, 유사 분열 진행하는 것은 PCM1 식에 의해 식별되지 심근 세포주기의 M 단계에서 분해된다. 또한 세포주기의 S 단계에서 모든 핵 후속 분석에서 제외한다. 이것은 2N과 4N 집단 사이 DAPI 강도와 그들을 포함 2N 인구 위에 DAPI 강도 모든 핵을 게이팅함으로써 달성 될 수있다.
그것은 점점이지만심장이 정상 노화와 다음과 같은 급성 부상 중 심근을 대체 할 수있는 능력을 가지고 있음을 인정,이 가능성의 원인과 정도는 논란이 남아있다. 또한, 심근 매출의 서로 다른 비율은 1,7,20-22을보고되었다. 이는 정확하게 파악하고 신 심근 세대 19 정량화의 어려움을 부분적으로 할 수있다. 대부분의 연구 만 조직 학적 분석의 사용과 심근 매출 및 갱신 2,4,23,24의 정량화에 대한 근절의 단백질을 포함하여 세포질 단백질의 발현을 통해 심근의 식별에 의존 한 날짜합니다. 이러한 방법의 사용은 증식 마커의 발현을 검출하거나, 여기에 설명 된대로, 티미 딘 유사체의 결합은 쉽게 심근 다른 심장 세포 유형의 오인을 초래할 수있다. 3D 공 초점 이미지의 사용은 제 이러한 문제를 완화하는 데 도움이 될 수 있지만ESE 방법은 비용과 시간이 소요된다. 흥미롭게도, 여기에 설명 된 프로토콜 네오 심근 핵 생성 주 당 0.17 %의 비율로 발생 보여준다. 이 최대 0.13 % 5 주간 이직률을 보여주는 기초 연구 세포 계측법 다른 흐름과 일치한다. 그것은 이전의 연구 2,5,25,26에서와 같이,이 데이터를 기반으로 연간 매출 비율을 추정 할 유혹하지만 매출의 비율이 동물 (13)의 수명 기간 동안 동적으로,이 부적절하다.
이 방법은 심근의 재생을 향상시키는 잠재력을 평가 치료제 또는 심근 회전율에 심장 질환의 효과 심근 배체의 비율을 조사하는 전위를 포함한 다수의 애플리케이션을 갖는다.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the British Heart Foundation, project grant PG/13/69/30454.
0.32 M sucrose | Sigma | 84100 | |
10 mM Tris-HCl (pH = 8) | Sigma | T3253 | |
5 mM CaCl2 | Sigma | c5086 | |
5 mM magnesium acetate | sigma | M-5661 | |
2.0 mM EDTA | Sigma | E5134 | |
0.5 mM EGTA | Sigma | 63779 | |
1 mM DTT | Sigma | D0632 | |
70 mM KCl | Sigma | P9541 | |
10 mM MgCl2 | Sigma | M8266 | |
1.5 mM spermine | Sigma | 85590 | |
Isotype rabbit IgG- ChIP Grade | abcam | abc7415 | |
Rabbit anti-PCM-1 antibody | Sigma | HPA023374 | |
Alexa Fluor 488 F(ab')2 Fragment of Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life technologies | A-11070 | |
cell strainers 70 μm and 100μm | Fisher scientific | 11597522, 11517532 | |
Glass dounce (40 ml) and pestle large clearance | Sigma | D9188-1SET | |
EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine) | Life technologies | A10044 | |
Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 647 Flow Cytometry Assay Kit | Life technologies | C10634 | This kit inlcudes reagents required for section, EdU reaction buffer, EdU fixative, saponin-based permeabilization solution and the reagents required for the EdU labelling cocktail. |
CyStain DNA 2 step kit, | Sysmex Partec | 05 5005 | This kit inlcudes reagents required for DAPI labelling (DNA staining solution) |
Probe homogeniser e.g. TissueRuptor | Qiagen | 9001273 | |
TissueRuptor Disposable Probes | Qiagen | 990890 | |
ultracentrifuge | Sorvall | ||
Facscanto II | BD Biosciences | ||
Ultracentrifuge Tube, Thinwall, Polypropylene. 38.5 mL, 25 x 89 mm | Beckman Coulter | 326823 | |
Bovine serum albumin | Sigma | A2153 |