عزل الفئران التاجي الأوعية الدموية خلايا العضلات الملساء
Summary
والغرض من هذا البروتوكول هو للتدليل على تقنيات العزل وثقافة الخلايا الأولية الفئران الأوعية الدموية العضلات الملساء (VSMCs) من الدورة التاجية. مرة واحدة وقد تم عزل VSMCs، ويمكن استخدامها في العديد من تقنيات زراعة القياسية.
Abstract
في حين تم تأسيس العزلة والثقافة من خلايا العضلات الملساء الوعائية (VSMCs) من السفن الكبيرة بشكل جيد، وسعينا إلى عزل والثقافة VSMCs من الدورة التاجية. أزيلت قلوب مع أقواس الأورطي سليمة وperfused عبر Langendorff الوراء مع حل الهضم تحتوي على 300 وحدة / مل من نوع كولاجيناز الثاني، 0.1 ملغ / مل مثبط التربسين فول الصويا و 1 M CaCl 2. وقد تم جمع perfusates في 15 دقيقة فترات لمدة 90 دقيقة، مكعبات بواسطة الطرد المركزي، معلق في وسائل الإعلام والطلاء، ومطلي على أطباق زراعة الأنسجة. تميزت VSMCs التي كتبها جود SM22α، α-SMA، وفيمنتين. واحدة من أهم مزايا استخدام هذه التقنية هو القدرة على عزل VSMCs من الدورة التاجية للفئران. على الرغم من أن عدد قليل من الخلايا التي تم الحصول عليها يمكن أن تحد من بعض التطبيقات التي يمكن استخدامها الخلايا، VSMCs التاجي معزولة يمكن استخدامها في مجموعة متنوعة من تقنيات زراعة الخلايا راسخة وأسايس. يمكن لدراسات التحقيق VSMCs من الفئران المعدلة وراثيا توفر مزيد من المعلومات حول بنية وظيفة ويشير العمليات المرتبطة بأمراض الأوعية الدموية.
Introduction
والهدف من هذه الطريقة هو عزل خلايا الأوعية الدموية العضلات الملساء (VSMCs) من الدورة التاجية الفئران لاستخدامها في زراعة الخلايا وتجارب زراعة الخلية القياسية. قمنا بتطوير هذه التقنية لتقييم الآليات الجزيئية لإعادة الأوعية الدموية في مرض السكري. لقد ذكرت سابقا الداخل إعادة الضخامي في الشرايين التاجية الحاجز في نموذج الفأر ديسيبل / ديسيبل من مرض السكري 1. ويرجع ذلك إلى كمية محدودة من الأنسجة الموجودة في التاجية الحاجز الفئران، وتقنيات تجريبية قياسية التحقيق التغييرات البروتين (مثل لطخة غربية) في الفئران ديسيبل / ديسيبل والسيطرة صعبة في أحسن الأحوال. وبالإضافة إلى ذلك، لقد أظهرنا سابقا أن مانع مستقبلات أنجيوتنسين (ARB) اللوسارتان يقلل من إعادة عرض لوحظت في الفئران ديسيبل DB / 2. لذلك، عزل VSMCs الابتدائية من الدورة التاجية يسمح لنا لمواصلة التحقيق التغيرات في النمط الظاهري VSMC أو مسارات تنشيط يشير في الفئران من السكري، والتي قد تكون contribuتينغ إلى سلبي إعادة شرين التاجي.
وإجمال العديد من الدراسات مسارات الإشارات الكنسي باستخدام VSMCs معزولة من الشريان الأورطي القوارض، وليس في كل سرير الأوعية الدموية محددة. ومع ذلك، لقد أثبتنا الأوعية الدموية سريرا إعادة محددة في التاجي، الأبهر، والتداولات المساريقي من ديسيبل الفئران ديسيبل / 1، مما يشير إلى VSMCs في كل سرير الأوعية الدموية قد يكون مختلفا. وبالتالي، فمن الضروري عزل VSMCs من كل سرير الأوعية الدموية من أجل فهم أفضل للتغيرات المرضية التي تحدث في كل مجموعة من VSMCs. وهناك عدد كبير من الطرق المختلفة لعزل وزراعة VSMCs الأبهر. ومع ذلك، في الوقت الراهن، هناك دراسة واحدة فقط التي تم نشرها على عزل VSMCs من الماوس التاجي تداول 3. تنغ وآخرون. كان أول من أشار إلى وسيلة لعزل VSMCs من الماوس الدورة الدموية التاجية. ومع ذلك، قمنا بتعديل البروتوكول بشكل كبير لأنها أيضا معزولة سل البطانيةليرة سورية. وقد استخدمت مختبرات أخرى أيضا البروتوكول من تنغ وآخرون لعزل myocytes الشرايين التاجية والهوائية خلايا العضلات الملساء 4،5. فإن التعديلات أدخلنا تسفر عن مجموعة من الخلايا التخصيب لVSMCs من الدورة التاجية.
نضح الوراء من قلب الثدييات معزولة، أو تقنية Langendorff، وقد تم تأسيسها في عام 1897 6 أوسكار Langendorff، ولا يزال يستخدم على نطاق واسع اليوم لعزل خلايا القلب والأوعية الدموية. تقنية المعروضة هنا، إلى جانب النهوض التعديلات الجينية الفئران الحديثة، ويوفر أداة قيمة لتوثيق التحقيق في سلوك الجزيئي للVSMCs من الدورة التاجية.
Protocol
Representative Results
Discussion
وكان الغرض من هذه الدراسة هو التكيف مع بروتوكولات العزل الخلية الحالية لزيادة الغلة من التاجي والأوعية الدموية على نحو سلس من قلوب الفئران. تم تنفيذ أكثر من عمل رائد في الأوعية الدموية البيولوجيا العضلات الملساء مع مثقف الفئران الأبهر خلايا العضلات الملساء. قدمت هذ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (R01HL056046 بال وK99HL116769 لجمعية الصحفيين التونسيين)، ومعهد الأبحاث في مستشفى الصعيد الوطني للطفولة (لPAL وجمعية الصحفيين التونسيين).
Materials
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 16140-071 | |
| HEPES 1M solution | Fisher | MT-25-060 | |
| Primocin – 20mL | Invivogen | ant-pm-2 | |
| DMEM (High Glucose, Sodium Pyruvate, L-Glutamine) | Life Technologies | 11995-065 | |
| MEM NEAA 10 mM 100X | Life Technologies | 11140-050 | |
| L-Glut 200 mM – Gibco | Life Technologies | 25030-081 | |
| Sterile Cell Strainer 100um nylon mesh | Fisher | 22363549 | |
| Nunclon Polystrene dish with lid, sterile, 35 mm | Fisher | 12-565-91 | |
| Harvard Apparatus black silk suture 5-0 | Fisher | 14-516-124 | |
| Collagenase Type-2 | Worthington Biochemical | LS004176 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor 25mg | Sigma | T6522 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid (clear) | Life Technologies | 14175-103 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid (phenol red) | Life Technologies | 14170-161 | |
| 5.0 ml heating coil with degassing bubble trap | Radnoti | 158830 | |
| 11 plus pump | Harvard Apparatus | 70-2208 | |
| Circulating heated water pump | any brand will work |
Riferimenti
- Katz, P. S., et al. Coronary arterioles in type 2 diabetic (db/db) mice undergo a distinct pattern of remodeling associated with decreased vessel stiffness. Basic Res Cardiol. 106 (6), 1123-1134 (2011).
- Husarek, K. E., et al. The angiotensin receptor blocker losartan reduces coronary arteriole remodeling in type 2 diabetic mice. Vascul Pharmacol. , (2015).
- Teng, B., Ansari, H. R., Oldenburg, P. J., Schnermann, J., Mustafa, S. J. Isolation and characterization of coronary endothelial and smooth muscle cells from A1 adenosine receptor-knockout mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 290 (4), H1713-H1720 (2006).
- Oldenburg, P. J., Wyatt, T. A., Sisson, J. H. Ethanol attenuates contraction of primary cultured rat airway smooth muscle cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 43 (5), 539-545 (2010).
- Xu, M., et al. Intracellular two-phase Ca2+ release and apoptosis controlled by TRP-ML1 channel activity in coronary arterial myocytes. Am J Physiol Cell Physiol. 304 (5), C458-C466 (2013).
- Skrzypiec-Spring, M., Grotthus, B., Szelag, A., Schulz, R. Isolated heart perfusion according to Langendorff—still viable in the new millennium. J Pharmacol Toxicol Methods. 55 (2), 113-126 (2007).
- Owens, G. K., Kumar, M. S., Wamhoff, B. R. Molecular regulation of vascular smooth muscle cell differentiation in development and disease. Physiol Rev. 84 (3), 767-801 (2004).
- Li, L., Miano, J. M., Cserjesi, P., Olson, E. N. SM22 alpha, a marker of adult smooth muscle, is expressed in multiple myogenic lineages during embryogenesis. Circ Res. 78 (2), 188-195 (1996).
- Santiago, J. J., et al. Cardiac fibroblast to myofibroblast differentiation in vivo and in vitro: expression of focal adhesion components in neonatal and adult rat ventricular myofibroblasts. Dev Dyn. 239 (6), 1573-1584 (2010).
- Fisher, S. A. Vascular smooth muscle phenotypic diversity and function. Physiol Genomics. 42A (3), 169-187 (2010).
- Archer, S. L. Diversity of phenotype and function of vascular smooth muscle cells. J Lab Clin Med. 127 (6), 524-529 (1996).
- Souza-Smith, F. M., et al. Mesenteric resistance arteries in type 2 diabetic db/db mice undergo outward remodeling. PLoS One. 6 (8), e23337 (2011).
- Thuroff, J. W., Hort, W., Lichti, H. Diameter of coronary arteries in 36 species of mammalian from mouse to giraffe. Basic Res Cardiol. 79 (2), 199-206 (1984).
