鼠冠状动脉血管平滑肌细胞的分离
Summary
此协议的目的是演示从冠脉循环鼠主要血管平滑肌细胞的分离和培养技术（血管平滑肌细胞）。一旦血管平滑肌细胞已被分离，它们可用于许多标准培养技术。
Abstract
虽然分离及大血管的血管平滑肌细胞（VSMC）的文化是公认的，我们试图从冠脉循环分离培养血管平滑肌细胞。用完整主动脉弓心中取出并经由逆行的Langendorff用含有300单位/ ml胶原酶II型，0.1毫克/毫升大豆胰蛋白酶抑制剂和1M 的 CaCl 2消化溶液灌注。所述灌流液分别以15分钟的间隔为90分钟，通过离心沉淀收集，再悬浮于电镀媒体，并接种在组织培养皿。通过SM22α的存在下，α-SMA，波形蛋白和血管平滑肌细胞进行表征。之一的使用这种技术的主要优点是，从小鼠的冠脉循环隔离血管平滑肌细胞的能力。虽然获得可以限制一些可用于其中细胞的应用程序单元的数量少，分离的冠状血管平滑肌细胞可以在多种成熟的细胞培养技术和阿萨用于YS。研究调查转基因小鼠的血管平滑肌细胞可以提供有关的结构功能和血管病变相关的信号传导过程的详细信息。
Introduction
该方法的目标是分离来自鼠冠状循环的血管平滑肌细胞（VSMC），用于在细胞培养物和标准细胞培养测定中使用。我们开发这种技术来评估在糖尿病血管重塑的分子机制。之前我们已经内向肥厚性重塑报道在1型糖尿病的的db / db小鼠模型中间隔冠状小动脉。由于在小鼠中隔冠状动脉发现组织的有限数量，标准的实验技术调查的db / db小鼠和对照小鼠的蛋白质变化（ 如免疫印迹）难以在最好的。此外，我们以前曾表明，血管紧张素受体 阻断剂（ARB）氯沙坦降低db / db小鼠2中观察到的重塑。因此，从冠脉循环主血管平滑肌细胞的隔离允许我们进一步调查在血管平滑肌细胞的表型或活化信号转导途径在糖尿病小鼠的变化，这可能是contribu婷不良冠脉动脉重塑。
许多研究已阐明了利用啮齿类动物主动脉，血管平滑肌细胞中分离规范的信号转导通路，而不是在每一个具体的血管床。然而，我们已经证明血管床在冠状动脉，主动脉具体重塑，和db / db小鼠1的肠系膜环流，这表明在各血管床的血管平滑肌细胞可以是不同的。因此，有必要分离来自每个血管床血管平滑肌，以便更好地理解在每一组的VSMCs发生的病理变化。有不同的方法进行分离和培养平滑肌细胞主动脉过多。然而，目前，仅存在一个已发布对来自小鼠冠脉循环3平滑肌细胞的分离研究。腾等 。是第一个报道的方法分离从鼠标冠脉循环血管平滑肌细胞;但是，我们有显著修订了协议，他们还分离内皮CELLS。其他实验室还使用从腾等的协议。分离冠状动脉细胞和气道平滑肌细胞4,5。我们已掺入的变动将产生高度富集用于从所述冠脉循环血管平滑肌细胞的细胞群。
在分离的哺乳动物心脏或者Langendorff灌注技术的逆行灌注，由奥斯卡的Langendorff成立于1897年6，目前仍在广泛使用的今天心血管细胞的分离。这里介绍的技术，加上现代的小鼠遗传修饰的进步，提供了从冠脉循环血管平滑肌细胞的分子行为的调查，接近一个有价值的工具。
Protocol
Representative Results
Discussion
这项研究的目的是适应现有的细胞分离协议，以增加冠状血管的产量从小鼠心脏流畅。大部分血管平滑肌生物学的开拓性工作与培养的大鼠主动脉平滑肌细胞进行。这些研究提供了控制血管平滑肌细胞生长，迁移和肥厚7分子机制的基础知识。然而，如该领域的进展，它变得明显VSMC表型和功能是由许多血管床的具体因素来控制。例如，相比于周围血管，冠状动脉显示不同的功能反应，损伤…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作是由美国国立卫生研究院（R01HL056046 PAL并K99HL116769到AJT）的研究所在全国儿童医院（PAL并AJT）的支持，。
Materials
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 16140-071 | |
| HEPES 1M solution | Fisher | MT-25-060 | |
| Primocin – 20mL | Invivogen | ant-pm-2 | |
| DMEM (High Glucose, Sodium Pyruvate, L-Glutamine) | Life Technologies | 11995-065 | |
| MEM NEAA 10 mM 100X | Life Technologies | 11140-050 | |
| L-Glut 200 mM – Gibco | Life Technologies | 25030-081 | |
| Sterile Cell Strainer 100um nylon mesh | Fisher | 22363549 | |
| Nunclon Polystrene dish with lid, sterile, 35 mm | Fisher | 12-565-91 | |
| Harvard Apparatus black silk suture 5-0 | Fisher | 14-516-124 | |
| Collagenase Type-2 | Worthington Biochemical | LS004176 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor 25mg | Sigma | T6522 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid (clear) | Life Technologies | 14175-103 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid (phenol red) | Life Technologies | 14170-161 | |
| 5.0 ml heating coil with degassing bubble trap | Radnoti | 158830 | |
| 11 plus pump | Harvard Apparatus | 70-2208 | |
| Circulating heated water pump | any brand will work |
Riferimenti
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