Isolering af murint koronar vaskulær glat muskelceller
Summary
Formålet med denne protokol er at demonstrere isolation og kultur teknikker til murine primære vaskulære glatte muskelceller (VSMC) fra koronar cirkulation. Når VSMC'er er blevet isoleret, kan de bruges til mange standard kultur teknikker.
Abstract
Mens isolering og dyrkning af vaskulære glatte muskelceller (VSMC) fra store skibe er veletableret, vi søgte at isolere og kultur VSMC'er fra koronar cirkulation. Hjerter med intakte aorta buer blev fjernet og perfunderet via retrograd Langendorff med fordøjelsen opløsning indeholdende 300 enheder / ml collagenase type II, 0,1 mg / ml sojabønnetrypsininhibitor og 1 M CaCl2. De perfusater blev opsamlet med 15 minutters intervaller i 90 minutter, pelleteret ved centrifugering, resuspenderet i plating medier, og udpladet på vævskulturskåle. VSMC blev karakteriseret ved tilstedeværelsen af SM22α, α-SMA, og vimentin. En af de vigtigste fordele ved at bruge denne teknik er evnen til at isolere VSMC fra koronar cirkulation af mus. Selvom det lille antal celler opnået kan begrænse nogle af de anvendelser, til hvilke kan anvendes cellerne kan isolerede koronare VSMC anvendes i en række veletablerede celledyrkningsteknikker og ASSAys. Undersøgelser undersøger VSMC fra genetisk modificerede mus kan give yderligere oplysninger om struktur-funktion og signalering processer forbundet med vaskulære patologier.
Introduction
Målet med denne fremgangsmåde er at isolere vaskulære glatte muskelceller (VSMC) fra det murine koronar omsætning til anvendelse i cellekultur og standard celledyrkningsassays. Vi udviklede denne teknik til at vurdere de molekylære mekanismer i vaskulær remodellering ved diabetes. Vi har tidligere rapporteret indad hypertrofisk remodellering i den septale koronararterioler i db / db musemodel for diabetes 1. På grund af den begrænsede mængde væv findes i de murine septumdefekter blodpropper, standard eksperimentelle teknikker, der undersøger protein ændringer (f.eks Western blot) i db / db mus og kontrolmus er vanskelige i bedste. Derudover har vi tidligere vist, at angiotensinreceptorblokker (ARB) losartan reducerer remodeling observeret i db / db-mus 2. Derfor isolering af primære VSMC fra koronar cirkulation giver os mulighed for yderligere at undersøge ændringer i VSMC fænotype eller aktiverede signaleringsveje i diabetiske mus, som kan være contribuTing til negativ koronar arteriole remodeling.
Talrige undersøgelser har belyst kanoniske signalveje ved anvendelse VSMC isoleret fra gnaver aorta, i stedet for i hvert enkelt vaskulære leje. Vi har imidlertid påvist vaskulære leje specifik remodeling i koronar, aorta, og mesenteriske oplag af db / db mus 1, hvilket tyder på VSMC i hvert vaskulære leje kan være anderledes. Det er derfor nødvendigt at isolere VSMC fra hver vaskulære leje for bedre at forstå de patologiske forandringer i hvert sæt VSMC. Der er en overflod af forskellige metoder til isolering og dyrkning af aorta VSMC. Men i øjeblikket, er der kun én undersøgelse, som er offentliggjort på isolering af VSMC fra muse koronar cirkulation 3. Teng et al. var den første til at rapportere en metode til isolering VSMC'er fra musen koronar omsætning; dog har vi ændret protokollen betydeligt som de isolerede også endotel cells. Andre labs har også brugt protokollen fra Teng et al. At isolere koronare arterielle myocytter og luftvejenes glatte muskelceller 4,5. Ændringerne Vi har indarbejdet vil give en population af celler stærkt beriget for VSMC fra koronar cirkulation.
Den retrograd perfusion af den isolerede pattedyr hjerte, eller Langendorff teknik, blev etableret i 1897 6 af Oscar Langendorff og er stadig i vid udstrækning anvendes i dag til isolering af hjerte-kar-celler. Teknikken præsenteres her, kombineret med udviklingen af moderne murine genetiske modifikationer, giver et værdifuldt redskab til nærmere undersøgelse af den molekylære adfærd VSMC'er fra koronar cirkulation.
Protocol
Representative Results
Discussion
Formålet med denne undersøgelse var at tilpasse eksisterende celleisolering protokoller til at forøge udbyttet af koronar vaskulær glat fra murine hjerter. Det meste af pionerarbejde i vaskulær glat muskulatur biologi blev udført med dyrket rotte aorta glatte muskelceller. Disse studier forudsat grundlæggende viden om molekylære mekanismer, der styrer VSMC vækst, migration og hypertrofi 7. Men som feltet skred frem, blev det klart, at VSMC fænotype og funktion blev kontrolleret af en række vaskulæ…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (R01HL056046 til PAL og K99HL116769 til AJT), og The Research Institute ved Landsdækkende Børnehospital (til PAL og AJT).
Materials
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 16140-071 | |
| HEPES 1M solution | Fisher | MT-25-060 | |
| Primocin – 20mL | Invivogen | ant-pm-2 | |
| DMEM (High Glucose, Sodium Pyruvate, L-Glutamine) | Life Technologies | 11995-065 | |
| MEM NEAA 10 mM 100X | Life Technologies | 11140-050 | |
| L-Glut 200 mM – Gibco | Life Technologies | 25030-081 | |
| Sterile Cell Strainer 100um nylon mesh | Fisher | 22363549 | |
| Nunclon Polystrene dish with lid, sterile, 35 mm | Fisher | 12-565-91 | |
| Harvard Apparatus black silk suture 5-0 | Fisher | 14-516-124 | |
| Collagenase Type-2 | Worthington Biochemical | LS004176 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor 25mg | Sigma | T6522 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid (clear) | Life Technologies | 14175-103 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid (phenol red) | Life Technologies | 14170-161 | |
| 5.0 ml heating coil with degassing bubble trap | Radnoti | 158830 | |
| 11 plus pump | Harvard Apparatus | 70-2208 | |
| Circulating heated water pump | any brand will work |
Riferimenti
- Katz, P. S., et al. Coronary arterioles in type 2 diabetic (db/db) mice undergo a distinct pattern of remodeling associated with decreased vessel stiffness. Basic Res Cardiol. 106 (6), 1123-1134 (2011).
- Husarek, K. E., et al. The angiotensin receptor blocker losartan reduces coronary arteriole remodeling in type 2 diabetic mice. Vascul Pharmacol. , (2015).
- Teng, B., Ansari, H. R., Oldenburg, P. J., Schnermann, J., Mustafa, S. J. Isolation and characterization of coronary endothelial and smooth muscle cells from A1 adenosine receptor-knockout mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 290 (4), H1713-H1720 (2006).
- Oldenburg, P. J., Wyatt, T. A., Sisson, J. H. Ethanol attenuates contraction of primary cultured rat airway smooth muscle cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 43 (5), 539-545 (2010).
- Xu, M., et al. Intracellular two-phase Ca2+ release and apoptosis controlled by TRP-ML1 channel activity in coronary arterial myocytes. Am J Physiol Cell Physiol. 304 (5), C458-C466 (2013).
- Skrzypiec-Spring, M., Grotthus, B., Szelag, A., Schulz, R. Isolated heart perfusion according to Langendorff—still viable in the new millennium. J Pharmacol Toxicol Methods. 55 (2), 113-126 (2007).
- Owens, G. K., Kumar, M. S., Wamhoff, B. R. Molecular regulation of vascular smooth muscle cell differentiation in development and disease. Physiol Rev. 84 (3), 767-801 (2004).
- Li, L., Miano, J. M., Cserjesi, P., Olson, E. N. SM22 alpha, a marker of adult smooth muscle, is expressed in multiple myogenic lineages during embryogenesis. Circ Res. 78 (2), 188-195 (1996).
- Santiago, J. J., et al. Cardiac fibroblast to myofibroblast differentiation in vivo and in vitro: expression of focal adhesion components in neonatal and adult rat ventricular myofibroblasts. Dev Dyn. 239 (6), 1573-1584 (2010).
- Fisher, S. A. Vascular smooth muscle phenotypic diversity and function. Physiol Genomics. 42A (3), 169-187 (2010).
- Archer, S. L. Diversity of phenotype and function of vascular smooth muscle cells. J Lab Clin Med. 127 (6), 524-529 (1996).
- Souza-Smith, F. M., et al. Mesenteric resistance arteries in type 2 diabetic db/db mice undergo outward remodeling. PLoS One. 6 (8), e23337 (2011).
- Thuroff, J. W., Hort, W., Lichti, H. Diameter of coronary arteries in 36 species of mammalian from mouse to giraffe. Basic Res Cardiol. 79 (2), 199-206 (1984).
