マウス冠動脈血管平滑筋細胞の単離
Summary
このプロトコルの目的は、冠循環からマウスの一次血管平滑筋細胞（VSMC）の単離および培養技術を実証することです。たVSMCが単離されたら、それらは、多くの標準的な培養技術のために使用することができます。
Abstract
大血管からの血管平滑筋細胞（VSMC）の単離および培養物が十分に確立されているが、我々は、冠循環からのVSMCを単離し、培養しようとしました。無傷の大動脈弓と心臓をコラゲナーゼタイプIIの300単位/ ml、0.1mg / mlの大豆トリプシン阻害剤および1MのCaCl 2を含有する消化溶液で逆行ランゲンドルフによって除去し、潅流しました。灌流液は、90分間、15分間隔で採取し、遠心分離によってペレット化し、培地をめっき中に再懸濁し、そして組織培養皿上にプレーティングしました。 VSMCをはSM22α、α-SMA、およびビメンチンの存在によって特徴付けられました。この技術を使用することの主な利点の一つは、マウスの冠循環からのVSMCを隔離する能力です。得られた細胞の数が少ないセルを利用することができるため、アプリケーションの一部を制限することができるが、単離された冠状動脈のVSMCは、十分に確立された細胞培養技術とASSA種々のに使用することができますYS。遺伝的に改変されたマウスからのVSMCを調査研究は、構造機能および血管の病理に関連したシグナル伝達過程に関するさらなる情報を提供することができます。
Introduction
この方法の目的は、細胞培養と、標準的な細胞培養アッセイで使用するために、マウス冠循環の血管平滑筋細胞（VSMC）を単離することです。我々は、糖尿病における血管リモデリングの分子機構を評価するためにこの技術を開発しました。我々は以前、糖尿病1のdb / dbマウスモデルにおける中隔の冠状動脈に肥大改造内側に報告しています。マウス中隔冠状動脈に見られる組織の限られた量を、デシベル/ dbのマウスおよび対照マウスにおけるタンパク質の変化（ 例えばウェスタンブロット）を調査し、標準的な実験技術は、最高の状態では困難です。加えて、我々は以前に、アンジオテンシン受容体遮断薬は、（ARB）が、ロサルタンでのdb / dbマウス2で観察されたリモデリングを減少することが示されています。したがって、冠循環からの一次VSMCをの単離は、私たちがさらにcontribuかもしれ糖尿病マウスにおけるVSMC表現型または活性化のシグナル伝達経路の変化を調査することができます有害冠状動脈リモデリングにティン。
多くの研究はむしろ、各特定の血管床に比べ、齧歯類大動脈から単離したVSMCを使用して、標準的なシグナル伝達経路を解明しました。しかし、私たちは、それぞれの血管床でのVSMCは異なる可能性があり示唆し、血管床冠動脈、大動脈内の特定のリモデリング、およびデシベル/ dbマウス1の腸間膜循環を実証しました。したがって、より良いたVSMCの各セットに生じる病理学的変化を理解するために、各血管床からのVSMCを単離することが必要です。大動脈のVSMCを単離し、培養するための異なる方法の茄多があります。しかし、現在、マウス冠循環3からのVSMCを単離する上で公開されている唯一の研究があります。テンら 。マウス冠循環からのVSMCを単離するための方法を報告した最初の。しかし、我々は、彼らはまた、単離された内皮セル画のように大幅にプロトコルを修正していますlsの。他のラボはまた、テンらからプロトコルを使用している。冠状動脈筋細胞及び気道平滑筋細胞4,5を分離します。私たちが組み込まれているの変化は非常に冠循環からのVSMCのために濃縮された細胞の集団が得られます。
単離された哺乳動物の心臓、またはランゲンドルフ技術の逆行性灌流は、オスカーランゲンドルフによって1897年6に設立され、現在でも広く心血管細胞の単離のために今日使用されています。現代のマウス遺伝子改変の進歩と相まってここで紹介する技術は、冠循環からのVSMCの分子挙動の近い調査のための貴重なツールを提供します。
Protocol
Representative Results
Discussion
この研究の目的は、マウスの心臓からの滑らかな冠血管の収量を増加させるために、既存の細胞単離プロトコールを適合させることでした。血管平滑筋の生物学における先駆的な仕事の大部分は培養ラット大動脈平滑筋細胞を用いて行きました。これらの研究は、VSMC増殖、移動および肥大7を制御する分子機構の基本的な知識を提供しました。フィールドが進むにつれてしかし、それ…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は（PALとK99HL116769 AJTにするR01HL056046）国立衛生研究所によってサポートされ、全国小児病院で研究所（PALとAJTへ）しました。
Materials
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 16140-071 | |
| HEPES 1M solution | Fisher | MT-25-060 | |
| Primocin – 20mL | Invivogen | ant-pm-2 | |
| DMEM (High Glucose, Sodium Pyruvate, L-Glutamine) | Life Technologies | 11995-065 | |
| MEM NEAA 10 mM 100X | Life Technologies | 11140-050 | |
| L-Glut 200 mM – Gibco | Life Technologies | 25030-081 | |
| Sterile Cell Strainer 100um nylon mesh | Fisher | 22363549 | |
| Nunclon Polystrene dish with lid, sterile, 35 mm | Fisher | 12-565-91 | |
| Harvard Apparatus black silk suture 5-0 | Fisher | 14-516-124 | |
| Collagenase Type-2 | Worthington Biochemical | LS004176 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor 25mg | Sigma | T6522 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid (clear) | Life Technologies | 14175-103 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid (phenol red) | Life Technologies | 14170-161 | |
| 5.0 ml heating coil with degassing bubble trap | Radnoti | 158830 | |
| 11 plus pump | Harvard Apparatus | 70-2208 | |
| Circulating heated water pump | any brand will work |
Riferimenti
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