Aislamiento de murino coronaria células musculares lisas vasculares
Summary
El objetivo de este protocolo es demostrar las técnicas de aislamiento y cultivo de las células del músculo liso vascular primaria murino (CMLV) de la circulación coronaria. Una vez que se han aislado CMLV, que se pueden utilizar para muchas técnicas de cultivo estándar.
Abstract
Mientras que el aislamiento y cultivo de las células del músculo liso vascular (CMLV) de buques de gran tamaño está bien establecida, hemos tratado de aislar y cultivar las CMLV de la circulación coronaria. Corazones con arcos aórticos intactos se retiraron y se sometieron a perfusión a través de Langendorff retrógrada con solución de digestión que contiene 300 unidades / ml de inhibidor de tripsina de soja ml de colagenasa tipo II, 0,1 mg / 1 y M CaCl 2. Los perfundidos se recogieron a intervalos de 15 min durante 90 min, se sedimentaron por centrifugación, se resuspendieron en medio de siembra, y se sembraron en placas de cultivo de tejidos. CMLV se caracterizaron por la presencia de SM22α, α-SMA y vimentina. Una de las principales ventajas del uso de esta técnica es la capacidad de aislar las CMLV de la circulación coronaria de los ratones. Aunque el pequeño número de células obtenidas pueden limitar algunas de las aplicaciones para las que se puedan usar las células, CMLV coronarias aisladas se puede utilizar en una variedad de técnicas de cultivo celular bien establecidos y ASSAys. Los estudios que investigan las CMLV de ratones modificados genéticamente pueden proporcionar más información sobre los procesos de señalización asociados con patologías vasculares estructura-función y.
Introduction
El objetivo de este método es aislar células de músculo liso vascular (CMLV) de la circulación coronaria murino para uso en cultivo de células y ensayos de cultivo celular estándar. Hemos desarrollado esta técnica para evaluar los mecanismos moleculares de la remodelación vascular en diabetes. Hemos informado anteriormente hacia el interior remodelación hipertrófica en las arteriolas coronarias septales en el modelo de ratón db / db de la diabetes 1. Debido a la limitada cantidad de tejido que se encuentra en las coronarias septales murinos, técnicas experimentales estándar que investigan cambios en las proteínas (por ejemplo, Western blot) en ratones db / db y de control son difíciles en el mejor. Además, hemos demostrado previamente que el bloqueador del receptor de angiotensina (ARB) losartán reduce la remodelación observada en los ratones db / db 2. Por lo tanto, el aislamiento de las CMLV primarias de la circulación coronaria nos permite investigar más a fondo los cambios en las CMLV fenotipo o vías de señalización activadas en ratones diabéticos, que pueden ser contribuciónting a la remodelación de las arteriolas coronarias adverso.
Numerosos estudios han dilucidado vías de señalización canónica utilizando CMLV aislados de aorta de roedores, en lugar de en cada lecho vascular específico. Sin embargo, hemos demostrado vascular-cama remodelación específico en coronaria, la aorta, y circulaciones mesentéricos de ratones db / db 1, lo que sugiere las CMLV en cada lecho vascular puede ser diferente. Por lo tanto, es necesario aislar CMLV de cada lecho vascular con el fin de comprender mejor los cambios patológicos que se producen en cada conjunto de CMLV. Hay una gran cantidad de diferentes métodos para el aislamiento y cultivo de las CMLV de la aorta. Sin embargo, en la actualidad, sólo hay un estudio que se ha publicado sobre el aislamiento de CMLV desde el ratón circulación coronaria 3. Teng et al. fue el primero en informar de un método para aislar CMLV de la circulación coronaria del ratón; Sin embargo, hemos modificado el protocolo de manera significativa, ya que también aislaron cel endotelialls. Otros laboratorios también han utilizado el protocolo de Teng et al. Aislar miocitos arteriales coronarias y de las vías respiratorias células musculares lisas 4,5. Las alteraciones que hemos incorporado producirán una población de células altamente enriquecida para CMLV de la circulación coronaria.
La perfusión retrógrada del corazón de los mamíferos aislado, o la técnica de Langendorff, se estableció en 1897 por Oscar 6 Langendorff y sigue siendo ampliamente utilizado hoy en día para el aislamiento de células cardiovasculares. La técnica que aquí se presenta, junto con el avance de las modificaciones genéticas modernas murinos, proporciona una valiosa herramienta para la investigación más profunda del comportamiento molecular de CMLV de la circulación coronaria.
Protocol
Representative Results
Discussion
El propósito de este estudio fue adaptar los protocolos de aislamiento de células existentes para aumentar el rendimiento de liso vascular coronaria del corazón murino. La mayor parte del trabajo pionero en la biología del músculo liso vascular se realizó con células de músculo liso de aorta de rata cultivadas. Estos estudios proporcionan conocimientos fundamentales de los mecanismos moleculares que controlan el crecimiento de VSMC, migración y la hipertrofia 7. Sin embargo, como el campo avanzaba, s…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (R01HL056046 a PAL y K99HL116769 a AJT), y el Instituto de Investigación del Hospital Nacional de Niños (para PAL y AJT).
Materials
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 16140-071 | |
| HEPES 1M solution | Fisher | MT-25-060 | |
| Primocin – 20mL | Invivogen | ant-pm-2 | |
| DMEM (High Glucose, Sodium Pyruvate, L-Glutamine) | Life Technologies | 11995-065 | |
| MEM NEAA 10 mM 100X | Life Technologies | 11140-050 | |
| L-Glut 200 mM – Gibco | Life Technologies | 25030-081 | |
| Sterile Cell Strainer 100um nylon mesh | Fisher | 22363549 | |
| Nunclon Polystrene dish with lid, sterile, 35 mm | Fisher | 12-565-91 | |
| Harvard Apparatus black silk suture 5-0 | Fisher | 14-516-124 | |
| Collagenase Type-2 | Worthington Biochemical | LS004176 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor 25mg | Sigma | T6522 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid (clear) | Life Technologies | 14175-103 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid (phenol red) | Life Technologies | 14170-161 | |
| 5.0 ml heating coil with degassing bubble trap | Radnoti | 158830 | |
| 11 plus pump | Harvard Apparatus | 70-2208 | |
| Circulating heated water pump | any brand will work |
Riferimenti
- Katz, P. S., et al. Coronary arterioles in type 2 diabetic (db/db) mice undergo a distinct pattern of remodeling associated with decreased vessel stiffness. Basic Res Cardiol. 106 (6), 1123-1134 (2011).
- Husarek, K. E., et al. The angiotensin receptor blocker losartan reduces coronary arteriole remodeling in type 2 diabetic mice. Vascul Pharmacol. , (2015).
- Teng, B., Ansari, H. R., Oldenburg, P. J., Schnermann, J., Mustafa, S. J. Isolation and characterization of coronary endothelial and smooth muscle cells from A1 adenosine receptor-knockout mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 290 (4), H1713-H1720 (2006).
- Oldenburg, P. J., Wyatt, T. A., Sisson, J. H. Ethanol attenuates contraction of primary cultured rat airway smooth muscle cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 43 (5), 539-545 (2010).
- Xu, M., et al. Intracellular two-phase Ca2+ release and apoptosis controlled by TRP-ML1 channel activity in coronary arterial myocytes. Am J Physiol Cell Physiol. 304 (5), C458-C466 (2013).
- Skrzypiec-Spring, M., Grotthus, B., Szelag, A., Schulz, R. Isolated heart perfusion according to Langendorff—still viable in the new millennium. J Pharmacol Toxicol Methods. 55 (2), 113-126 (2007).
- Owens, G. K., Kumar, M. S., Wamhoff, B. R. Molecular regulation of vascular smooth muscle cell differentiation in development and disease. Physiol Rev. 84 (3), 767-801 (2004).
- Li, L., Miano, J. M., Cserjesi, P., Olson, E. N. SM22 alpha, a marker of adult smooth muscle, is expressed in multiple myogenic lineages during embryogenesis. Circ Res. 78 (2), 188-195 (1996).
- Santiago, J. J., et al. Cardiac fibroblast to myofibroblast differentiation in vivo and in vitro: expression of focal adhesion components in neonatal and adult rat ventricular myofibroblasts. Dev Dyn. 239 (6), 1573-1584 (2010).
- Fisher, S. A. Vascular smooth muscle phenotypic diversity and function. Physiol Genomics. 42A (3), 169-187 (2010).
- Archer, S. L. Diversity of phenotype and function of vascular smooth muscle cells. J Lab Clin Med. 127 (6), 524-529 (1996).
- Souza-Smith, F. M., et al. Mesenteric resistance arteries in type 2 diabetic db/db mice undergo outward remodeling. PLoS One. 6 (8), e23337 (2011).
- Thuroff, J. W., Hort, W., Lichti, H. Diameter of coronary arteries in 36 species of mammalian from mouse to giraffe. Basic Res Cardiol. 79 (2), 199-206 (1984).
