Isolement de murin coronaire vasculaires cellules de muscle lisse
Summary
Le but de ce protocole est de démontrer les techniques d'isolement et de culture de cellules murines primaires musculaires lisses vasculaires (CMLV) de la circulation coronaire. Une fois que les CMLV ont été isolés, ils peuvent être utilisés pour de nombreuses techniques de culture standard.
Abstract
Bien que l'isolement et la culture des cellules vasculaires musculaires lisses (CMLV) de grands navires est bien établi, nous avons cherché à isoler et la culture CMLV de la circulation coronaire. Coeurs avec des arcs aortiques intacts ont été enlevés et perfusées via rétrograde Langendorff avec une solution de digestion contenant 300 unités / ml de collagénase de type II, de 0,1 mg / inhibiteur de trypsine de soja ml et 1 M CaCl 2. Les perfusats ont été prélevés à intervalles de 15 minutes pendant 90 min, centrifugées, remises en suspension dans un milieu de plaquage et étalées sur des boîtes de culture tissulaire. CMLV ont été caractérisées par la présence de SM22α, α-SMA et vimentine. L'un des principaux avantages de l'utilisation de cette technique est la possibilité d'isoler les CMLV de la circulation coronaire chez la souris. Bien que le petit nombre de cellules obtenues peuvent limiter certaines des applications pour lesquelles les cellules peuvent être utilisées, les CMLV coronaires isolés peuvent être utilisés dans une variété de techniques et assa bien établies culture cellulaireys. Les études portant sur les CMLV de souris génétiquement modifiées peuvent fournir de plus amples informations sur la structure-fonction et des processus de signalisation associés aux pathologies vasculaires.
Introduction
Le but de cette méthode consiste à isoler les cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV) à partir de la circulation coronaire murin pour une utilisation dans une culture cellulaire standard et des analyses de culture cellulaire. Nous avons développé cette technique pour évaluer les mécanismes moléculaires de remodelage vasculaire dans le diabète. Nous avons précédemment rapporté à l' intérieur un remodelage hypertrophique dans les artérioles coronaires septal dans le modèle de souris db / db de diabète 1. En raison de la quantité limitée de tissu trouvés dans les coronaries septal murins, des techniques expérimentales classiques enquête changements de protéines (par exemple de Western blot) chez la souris db / db et de contrôle sont difficiles au mieux. En outre, nous avons précédemment montré que l'inhibiteur des récepteurs de l' angiotensine (ARA) losartan réduit le remodelage observé chez les souris db / db 2. Par conséquent, l'isolement des CMLV primaires de la circulation coronaire nous permet d'étudier en outre des changements dans les CMLV phénotype ou voies activées de signalisation chez les souris diabétiques, qui peuvent être contributing à défavorable coronaire artériole remodelage.
De nombreuses études ont permis d'élucider les voies de signalisation canoniques utilisant CMLV isolées à partir de l'aorte de rongeurs, plutôt que dans chaque lit vasculaire spécifique. Cependant, nous avons démontré vasculaire lit remodelage spécifique dans coronaire, l' aorte et circulations mésentériques de souris db / db 1, suggérant les CMLV dans chaque lit vasculaire peut être différent. Par conséquent, il est nécessaire d'isoler les CMLV de chaque lit vasculaire afin de mieux comprendre les changements pathologiques qui se produisent dans chaque ensemble de CMLV. Il y a une pléthore de méthodes différentes pour isoler et cultiver les CMLV aortiques. Cependant, actuellement, il n'y a qu'une seule étude qui a été publiée sur l'isolement de CMLV de la souris de la circulation coronaire 3. Teng et al. a été le premier à signaler un procédé pour isoler les CMLV de la circulation coronaire de souris; cependant, nous avons modifié le protocole de manière significative car ils ont également isolé cel endothélialels. D' autres laboratoires ont également utilisé le protocole de Teng et al. , Afin d' isoler les myocytes artérielles coronaires et des voies aériennes des cellules musculaires lisses de 4,5. Les modifications que nous avons incorporés donneront une population de cellules hautement enrichi pour CMLV de la circulation coronaire.
La perfusion rétrograde du cœur de mammifère isolé, ou la technique de Langendorff, a été créé en 1897 par 6 Oscar Langendorff et est encore largement utilisé aujourd'hui pour l'isolement des cellules cardiovasculaires. La technique présentée ici, couplé avec l'avancement des modifications génétiques murins modernes, fournit un outil précieux pour examiner de plus près le comportement moléculaire de CMLV de la circulation coronaire.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le but de cette étude était d'adapter les protocoles d'isolement cellulaire existants pour augmenter le rendement des coronaires lisses vasculaires des coeurs murins. La plupart des travaux de pionnier dans la biologie vasculaire lisse musculaire a été réalisée avec des cellules musculaires lisses de l'aorte de rat en culture. Ces études ont fourni des connaissances fondamentales sur les mécanismes moléculaires qui contrôlent la croissance des CMLV, la migration et l' hypertrophie 7.…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par les National Institutes of Health (R01HL056046 PAL et K99HL116769 à AJT), et l'Institut de recherche de l'Hôpital pour enfants Nationwide (PAL et AJT).
Materials
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 16140-071 | |
| HEPES 1M solution | Fisher | MT-25-060 | |
| Primocin – 20mL | Invivogen | ant-pm-2 | |
| DMEM (High Glucose, Sodium Pyruvate, L-Glutamine) | Life Technologies | 11995-065 | |
| MEM NEAA 10 mM 100X | Life Technologies | 11140-050 | |
| L-Glut 200 mM – Gibco | Life Technologies | 25030-081 | |
| Sterile Cell Strainer 100um nylon mesh | Fisher | 22363549 | |
| Nunclon Polystrene dish with lid, sterile, 35 mm | Fisher | 12-565-91 | |
| Harvard Apparatus black silk suture 5-0 | Fisher | 14-516-124 | |
| Collagenase Type-2 | Worthington Biochemical | LS004176 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor 25mg | Sigma | T6522 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid (clear) | Life Technologies | 14175-103 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid (phenol red) | Life Technologies | 14170-161 | |
| 5.0 ml heating coil with degassing bubble trap | Radnoti | 158830 | |
| 11 plus pump | Harvard Apparatus | 70-2208 | |
| Circulating heated water pump | any brand will work |
Riferimenti
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