Murine कोरोनरी संवहनी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं का अलगाव
Summary
इस प्रोटोकॉल के प्रयोजन के अलगाव और संस्कृति कोरोनरी परिसंचरण से murine प्राथमिक संवहनी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं की तकनीक (VSMCs) का प्रदर्शन है। एक बार जब VSMCs पृथक किया गया है, वे कई मानक संस्कृति तकनीक के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
Abstract
जबकि अलगाव और बड़े जहाजों से संवहनी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं (VSMCs) की संस्कृति में अच्छी तरह से स्थापित है, हम कोरोनरी परिसंचरण से अलग और संस्कृति VSMCs करने की मांग की। बरकरार महाधमनी मेहराब के साथ दिल हटा दिया है और पाचन समाधान collagenase प्रकार द्वितीय, 0.1 मिलीग्राम / एमएल सोयाबीन trypsin अवरोध और 1 एम 2 CaCl की 300 इकाइयों / एमएल युक्त के साथ प्रतिगामी Langendorff के माध्यम से भरकर रखा गया था। perfusates 90 मिनट के लिए 15 मिनट के अंतराल, centrifugation द्वारा pelleted पर एकत्र किए गए थे, चढ़ाना मीडिया में resuspended, और टिशू कल्चर व्यंजन पर चढ़ाया। VSMCs SM22α की उपस्थिति, α-SMA, और vimentin की विशेषता थे। इस तकनीक का उपयोग करने का मुख्य लाभ में से एक चूहों के कोरोनरी परिसंचरण से VSMCs को अलग-थलग करने की क्षमता है। जो आवेदन के लिए कोशिकाओं का उपयोग किया जा सकता है कुछ सीमित कर सकते हैं प्राप्त कोशिकाओं की संख्या में छोटे, पृथक कोरोनरी VSMCs अच्छी तरह से स्थापित सेल संस्कृति तकनीक और Assa की एक किस्म में इस्तेमाल किया जा सकता हैवाई एस। आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों से VSMCs की जांच के अध्ययन संरचना समारोह और संकेत संवहनी विकृतियों के साथ जुड़े प्रक्रियाओं के बारे में और अधिक जानकारी प्रदान कर सकते हैं।
Introduction
इस पद्धति का लक्ष्य सेल संस्कृति और मानक सेल संस्कृति assays में उपयोग के लिए murine कोरोनरी परिसंचरण से संवहनी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं (VSMCs) को अलग-थलग करने के लिए है। हम मधुमेह में संवहनी remodeling के आणविक तंत्र का आकलन करने के लिए इस तकनीक को विकसित किया है। हम पहले से मधुमेह 1 की डीबी / DB माउस मॉडल में सेप्टल कोरोनरी धमनियों में hypertrophic remodeling आवक की सूचना है। Murine सेप्टल coronaries में पाया ऊतक की सीमित मात्रा के कारण, मानक प्रयोगात्मक डीबी / DB और नियंत्रण चूहों में प्रोटीन परिवर्तन (जैसे पश्चिमी धब्बा) की जांच की तकनीक पर सबसे अच्छा मुश्किल हो जाता है। इसके अलावा, हम पहले से पता चला है कि एंजियोटेनसिन रिसेप्टर अवरोधक (एआरबी) losartan remodeling डीबी / DB चूहों 2 में मनाया को कम कर देता है। इसलिए, कोरोनरी परिसंचरण से प्राथमिक VSMCs के अलगाव हमें आगे मधुमेह चूहों में VSMC phenotype में परिवर्तन या संकेत सक्रिय रास्ते, योगदान हो सकता है जो जांच करने के लिए अनुमति देता हैटिंग प्रतिकूल कोरोनरी धमनियों जैसे remodeling के लिए।
कई अध्ययनों से नहीं बल्कि प्रत्येक विशिष्ट संवहनी बिस्तर में से कृंतक महाधमनी, से अलग VSMCs का उपयोग कर विहित संकेत दे रास्ते elucidated है। हालांकि, हम नाड़ी-बिस्तर कोरोनरी, महाधमनी में विशिष्ट remodeling, और डीबी / DB चूहों 1 की mesenteric परिसंचरण का प्रदर्शन किया है, प्रत्येक नाड़ी बिस्तर में VSMCs सुझाव अलग हो सकता है। इसलिए, यह क्रम में बेहतर VSMCs के प्रत्येक सेट में होने वाली रोग परिवर्तन को समझने के लिए प्रत्येक नाड़ी बिस्तर से VSMCs को अलग करने के लिए आवश्यक है। अलग-थलग करने और महाधमनी VSMCs संवर्धन के लिए विभिन्न तरीकों के ढेर सारे हैं। हालांकि, वर्तमान में, वहाँ केवल एक अध्ययन है कि माउस कोरोनरी परिसंचरण 3 से VSMCs के अलगाव पर प्रकाशित किया गया है। टेंग एट अल। पहले माउस कोरोनरी परिसंचरण से VSMCs अलग-थलग करने के लिए एक विधि रिपोर्ट करने के लिए किया गया था; हालांकि, हम काफी प्रोटोकॉल में संशोधन किया है वे भी endothelial सेल पृथक रूपरास। अन्य प्रयोगशालाओं भी टेंग एट अल से प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया है। कोरोनरी धमनी myocytes और airway चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं 4,5 अलग करने के लिए। परिवर्तन हम शामिल किया है कोशिकाओं को अत्यधिक कोरोनरी परिसंचरण से VSMCs के लिए समृद्ध की आबादी निकलेगा।
पृथक स्तनधारी दिल, या Langendorff तकनीक का प्रतिगामी छिड़काव, ऑस्कर Langendorff द्वारा 1897 6 में स्थापित किया गया था और अभी भी व्यापक रूप से हृदय की कोशिकाओं के अलगाव के लिए आज प्रयोग किया जाता है। यहाँ प्रस्तुत तकनीक, आधुनिक murine आनुवंशिक संशोधन की उन्नति के साथ मिलकर, कोरोनरी परिसंचरण से VSMCs की आणविक व्यवहार के करीब जांच के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण प्रदान करता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस अध्ययन का उद्देश्य murine दिल से चिकनी कोरोनरी संवहनी की पैदावार बढ़ाने के लिए मौजूदा सेल अलगाव प्रोटोकॉल अनुकूल करने के लिए किया गया था। संवहनी चिकनी मांसपेशियों जीव विज्ञान में अग्रणी काम के अधिकां?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम के स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा समर्थित किया गया था (R01HL056046 पाल और K99HL116769 एजेटी), और (करने के लिए पाल और एजेटी) अनुसंधान संस्थान राष्ट्रव्यापी बच्चों के अस्पताल में।
Materials
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 16140-071 | |
| HEPES 1M solution | Fisher | MT-25-060 | |
| Primocin – 20mL | Invivogen | ant-pm-2 | |
| DMEM (High Glucose, Sodium Pyruvate, L-Glutamine) | Life Technologies | 11995-065 | |
| MEM NEAA 10 mM 100X | Life Technologies | 11140-050 | |
| L-Glut 200 mM – Gibco | Life Technologies | 25030-081 | |
| Sterile Cell Strainer 100um nylon mesh | Fisher | 22363549 | |
| Nunclon Polystrene dish with lid, sterile, 35 mm | Fisher | 12-565-91 | |
| Harvard Apparatus black silk suture 5-0 | Fisher | 14-516-124 | |
| Collagenase Type-2 | Worthington Biochemical | LS004176 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor 25mg | Sigma | T6522 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid (clear) | Life Technologies | 14175-103 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid (phenol red) | Life Technologies | 14170-161 | |
| 5.0 ml heating coil with degassing bubble trap | Radnoti | 158830 | |
| 11 plus pump | Harvard Apparatus | 70-2208 | |
| Circulating heated water pump | any brand will work |
Riferimenti
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