Summary
This protocol is prepared to share our method of isolating mouse coronary endothelial cells for the purpose of imaging or to conduct molecular biological experiments.
Abstract
Endotelceller linje den indre væg af blodkar og spiller en vigtig rolle i reguleringen af vaskulær tonus, vaskulær permeabilitet, og nye vaskulær formation. Endotelcelle dysfunktion er impliceret i udviklingen og progressionen af mange cardiovaskulære sygdomme, herunder iskæmisk hjertesygdom. For at undersøge funktionen og karakterisering af koronare endotelceller, celleisolering er det første skridt, og det kræver høj renhed og mængde til at udføre efterfølgende eksperimenter. Denne protokol beskriver en effektiv fremgangsmåde til isolering voksne mus koronare endotelceller. Musen hjerte dissekeres og hakket i små stykker. Efter fordøjelsen af hjertet ved hjælp dispase og collagenase II cellerne vasket og inkuberet med magnetiske kugler, der er konjugeret med anti-CD31 antistof. Perlerne med endotelceller vaskes flere gange og er klar til brug i forskellige anvendelser, herunder billeddannelse og molekylærbiologiske experimeNTS. Effektiv isolering giver ca. 10 4 celler pr ét hjerte med over 90% renhed.
Introduction
Musemodeller for forskellige kardiovaskulære sygdomme og metaboliske lidelser bærer fysiologiske og molekylære ændringer, som ligner dem, der findes i patienter. Endvidere genetisk ændring af mus er et stærkt værktøj, der giver os mulighed for at undersøge det patogene rolle af specifikke gener i udviklingen og progressionen af sygdomme. I dag, celle-typespecifikke gen-knock-in eller udtjekning mus let genereres i mange laboratorier og måling af mRNA og protein niveauer i bestemte celletyper er det første skridt i at afgøre, om musene blev virkelig genetisk modificeret.
Endotel er et tyndt enkelt lag af endotelceller (EC'er), der i indre vaskulære væg. Endotelceller spiller en kritisk rolle ved regulering af vaskulær spændinger, vaskulær permeabilitet, og nye vaskulær dannelse 1,2. Endothelial dysfunktion er et kendetegn for mange patologiske tilstande og ændringer i endotelfunktion kan føre til forskellige bil-kar sygdomme 3,4. Det er således væsentligt at studere funktionen af endotelceller under fysiologiske og patofysiologiske tilstande.
Der er flere måder at isolere EC'er 5-8 og isoleringen metode skal optimeres afhængigt af hvilke væv og arter vil blive anvendt. Dette skyldes EC'er fra forskellige væv vise en høj grad af heterogenitet med hensyn til deres overflademarkører og proteinekspression 9. Vellykket isolering af endotelceller kan ofte være udfordrende og kræver en vis grad af uddannelse og praksis. Når opnået, metoden til isolering foreslået i denne protokol viser sig at være stabile og effektive.
Det overordnede mål med denne metode er at opnå musen koronar EC'er (MCECs) af høj kvalitet og kvantitet. Selvom mængden af celler opsamlet fra et hjerte er mindre end celler opsamlet fra andre væv ved anvendelse af andre teknikker, giver denne teknik stadig better kvalitet. Renheden af endotelceller i den resulterende population er større end 90%. Således ville denne teknik være ideel til applikationer, der er afhængige af rent isolerede endotelceller såsom cell imaging.
Protocol
Representative Results
Discussion
De mest anvendte endotelceller i forskning er humane navlevene-endotelceller (HUVEC'er) på grund af deres bekvemmelighed og let dyrkning. Men en masse forskning kræver adgang til en fysiologisk model opnås ved isolering af endotelceller fra andre specifikke organer 10. Endotelceller udgør en meget lille population af celler i hjertevævet; deres isolation og dyrkning kan vise sig at være meget vanskeligt.
Der er tre kritiske trin i denne protokol. Den første er at skylle…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af bevilling fra National Institutes of Health (HL115578 til A. Makino).
Materials
| BSA | Sigma | A3311-10G | |
| EDTA | Fisher | BP120-500 | |
| HBSS | Fisher | SH3026801 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H4034-500G | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021-1KG | |
| Sheep anti-rat IgG beads | Life Technologies | F-410L | DynaBeads pan mouse IgG , Thermo Fisher Scientific, cat# 11035 |
| Rat anti-mouse PECAM Antibody | BD Pharmigen | 550274 | BD Biosciences |
| IFCS | Fisher | SH30072.04 | |
| M199 | Fisher | MT10060-CV | |
| Dispase (Neutral Protease) | Worthington Biochemical Corp./Fisher | LS02109 | |
| Collagenase Type II | Worthington Biochemical Corp./Fisher | LS004176 | |
| Glycerol | Fisher | BP381-1 | |
| Igepal | Sigma | 13021-50ml | I3021-50 ml |
| Phosphatase inhibitor cocktail | Sigma | P0044-1ml | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340-1 ml | |
| Heparin | Sigma | H3149-100KU | |
| FBS | Fisher/Mediatech | MT35010CV | |
| D-Valine | Sigma | V1255-5G | |
| EGS | BD | 356006 | Corning |
| Penicillin/Streptomycin | Fisher/Mediatech | MT-30-002-Cl | MT-30-002-CI |
Riferimenti
- Michiels, C. Endothelial cell functions. J Cell Physiol. 196, 430-443 (2003).
- Sumpio, B. E., Riley, J. T., Dardik, A. Cells in focus: endothelial cell. Int J Biochem Cell Biol. 34, 1508-1512 (2002).
- Cines, D. B., et al. Endothelial cells in physiology and in the pathophysiology of vascular disorders. Blood. 91, 3527-3561 (1998).
- Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. Endothelial function and dysfunction: testing and clinical relevance. Circulation. 115, 1285-1295 (2007).
- Jin, Y., Liu, Y., Antonyak, M., Peng, X. Isolation and characterization of vascular endothelial cells from murine heart and lung. Methods Mol Biol. 843, 147-154 (2012).
- Makino, A., Platoshyn, O., Suarez, J., Yuan, J. X., Dillmann, W. H. Downregulation of connexin40 is associated with coronary endothelial cell dysfunction in streptozotocin-induced diabetic mice. Am J Physiol Cell Physiol. 295, C221-C230 (2008).
- Marelli-Berg, F. M., Peek, E., Lidington, E. A., Stauss, H. J., Lechler, R. I. Isolation of endothelial cells from murine tissue. J Immunol Methods. 244, 205-215 (2000).
- van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., vander Linden, E., Griffioen, A. W. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nat Protoc. 3, 1085-1091 (2008).
- Nolan, D. J., et al. Molecular signatures of tissue-specific microvascular endothelial cell heterogeneity in organ maintenance and regeneration. Dev Cell. 26, 204-219 (2013).
- Sobczak, M., Dargatz, J., Chrzanowska-Wodnicka, M. Isolation and culture of pulmonary endothelial cells from neonatal mice. J Vis Exp. , (2010).
- Makino, A., Dai, A., Han, Y., Youssef, K. D., Wang, W., Donthamsetty, R., Scott, B. T., Wang, H., Dillmann, W. H. O-GlcNAcase overexpression reverses coronary endothelial cell dysfunction in type 1 diabetic mice. Am J Physiol Cell Physiol. 309, C593-C599 (2015).
- Sasaki, K., Donthamsetty, R., Heldak, M., Cho, Y., Scott, B. T., Makino, A. VDAC: old protein with new roles in diabetes. Am J Physiol Cell Physiol. 303, C1055-C1060 (2012).
