Isolierung von Maus-Koronar-Endothelzellen
Summary
This protocol is prepared to share our method of isolating mouse coronary endothelial cells for the purpose of imaging or to conduct molecular biological experiments.
Abstract
Endothelzellen kleiden die Innenwand der Blutgefäße und eine wichtige Rolle bei der Regulation des Gefäßtonus, vaskuläre Permeabilität spielen und neue Gefäßbildung. Endothelzelldysfunktion ist in der Entwicklung und dem Fortschreiten vieler kardiovaskulärer Erkrankungen, einschließlich ischämischer Herzkrankheit beteiligt ist. Um die Funktion und Charakterisierung von koronaren Endothelzellen untersuchen, Zellisolierung ist der erste Schritt, und es erfordert eine hohe Reinheit und Menge zur nachfolgenden Experimenten durchzuführen. Dieses Protokoll beschreibt ein effizientes Verfahren adulten Maus-Koronar-Endothelzellen zu isolieren. Die Maus Herz wird in kleine Stücke zerschnitten und zerkleinert. Nach der Verdauung des Herzens unter Verwendung Dispase und Kollagenase II werden die Zellen gewaschen und mit magnetischen Kügelchen inkubiert, die mit Anti-CD31-Antikörper konjugiert sind. Die Kügelchen mit Endothelzellen sind mehrmals gewaschen und bereit sind, in verschiedenen Anwendungen zu verwenden, einschließlich Bildgebung und molekularbiologische Experiments. Effiziente Isolierung ergibt etwa 10 4 Zellen pro ein Herz mit über 90% Reinheit.
Introduction
Mausmodelle verschiedener kardiovaskulärer Erkrankungen und Stoffwechselstörungen tragen physiologischen und molekularen Veränderungen, die mit denen in Patienten gefunden ähnlich sind. Weiterhin ist die genetische Veränderung von Mäusen ein leistungsfähiges Werkzeug, das uns die pathogene Rolle spezifischer Gene bei der Entwicklung und dem Fortschreiten der Krankheiten zu untersuchen erlaubt. Heutzutage zelltypspezifische Gen-Knock-in oder -out Mäuse werden in vielen Labors und die Messung von mRNA und Protein-Ebene in spezifischen Zelltypen ist der erste Schritt bei der Bestimmung, ob die Mäuse wurden wirklich genetisch veränderten leicht erzeugt.
Das Endothel ist eine dünne einzelne Schicht aus Endothelzellen (ECs), die Linien der inneren Gefäßwand. Endothelial – Zellen spielen eine entscheidende Rolle 1,2 Gefäßspannung, die vaskuläre Permeabilität und neue Gefäßbildung bei der Regulierung. Endotheliale Dysfunktion ist ein Markenzeichen vieler pathologischer Zustände und Veränderungen in der Endothelfunktion zu verschiedenen Auto führen kannKreislauf- Erkrankungen 3,4. Es ist somit signifikant die Funktion von Endothelzellen unter physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen zu studieren.
Es gibt mehrere Möglichkeiten , um ECs isolieren 5-8 und die Isolierungsmethode muss optimiert werden , abhängig von dem Gewebe und Arten verwendet. Dies liegt daran , ECs aus verschiedenen Geweben hinsichtlich ihrer Oberflächenmarker und Proteinexpression 9 eine hohe Heterogenität anzuzeigen. Erfolgreiche Isolierung von Endothelzellen kann oft schwierig sein und erfordert ein gewisses Maß an Ausbildung und Praxis. Einmal erreicht, erweist sich die Methode der Isolierung in diesem Protokoll vorgeschlagen, stabil und effizient zu sein.
Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist, Maus koronarer ECs (MCECs) von hoher Qualität und Quantität zu erhalten. Auch wenn die Menge der Zellen, die aus einem Herzen gesammelt weniger als aus anderen Geweben gesammelten Zellen unter Verwendung anderer Techniken, diese Technik bietet noch better Qualität. Die Reinheit von Endothelzellen in der resultierenden Population größer ist als 90%. Somit wäre diese Technik ideal für Anwendungen, die auf rein isolierten Endothelzellen verlassen wie Cell Imaging.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die am häufigsten verwendeten Endothelzellen in Forschung sind menschliche Nabelschnurvenen-Endothelzellen (HUVECs) wegen ihrer Bequemlichkeit und Leichtigkeit der Kultivierung. Jedoch erfordert eine Menge Forschung die Verfügbarkeit eines physiologischen Modells durch die Isolierung von Endothelzellen aus anderen spezifischen Organen 10 erreicht. Endothelial-Zellen machen einen sehr geringen Population von Zellen in dem Herzgewebe auf; ihre Isolation und Kultivierung kann sich als sehr schwierig erwiesen. …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch die Gewährung von den National Institutes of Health (HL115578 A. Makino) unterstützt.
Materials
| BSA | Sigma | A3311-10G | |
| EDTA | Fisher | BP120-500 | |
| HBSS | Fisher | SH3026801 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H4034-500G | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021-1KG | |
| Sheep anti-rat IgG beads | Life Technologies | F-410L | DynaBeads pan mouse IgG , Thermo Fisher Scientific, cat# 11035 |
| Rat anti-mouse PECAM Antibody | BD Pharmigen | 550274 | BD Biosciences |
| IFCS | Fisher | SH30072.04 | |
| M199 | Fisher | MT10060-CV | |
| Dispase (Neutral Protease) | Worthington Biochemical Corp./Fisher | LS02109 | |
| Collagenase Type II | Worthington Biochemical Corp./Fisher | LS004176 | |
| Glycerol | Fisher | BP381-1 | |
| Igepal | Sigma | 13021-50ml | I3021-50 ml |
| Phosphatase inhibitor cocktail | Sigma | P0044-1ml | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340-1 ml | |
| Heparin | Sigma | H3149-100KU | |
| FBS | Fisher/Mediatech | MT35010CV | |
| D-Valine | Sigma | V1255-5G | |
| EGS | BD | 356006 | Corning |
| Penicillin/Streptomycin | Fisher/Mediatech | MT-30-002-Cl | MT-30-002-CI |
Riferimenti
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