This protocol is prepared to share our method of isolating mouse coronary endothelial cells for the purpose of imaging or to conduct molecular biological experiments.
Endotelceller linje den inre väggen av blodkärlen och spelar en viktig roll vid regleringen av det vaskulära tillståndet, vaskulär permeabilitet, och ny kärlbildning. Endothelial celldysfunktion är inblandad i utvecklingen och utvecklingen av många kardiovaskulära sjukdomar, inklusive ischemisk hjärtsjukdom. Att undersöka funktionen och karakterisering av koronara endotelceller, är cellisolering det första steget och det kräver hög renhet och mängd för att utföra efterföljande experiment. Detta protokoll beskriver en effektiv metod för att isolera en vuxen mus koronära endotelceller. Musen hjärta är dissekeras och hackades till små bitar. Efter uppslutningen av hjärtat med användning av dispas och kollagenas II, tvättas cellerna och inkuberas med magnetiska kulor som är konjugerade med anti-CD31-antikropp. Pärlorna med endotelceller tvättas flera gånger och är redo för användning i olika tillämpningar, inklusive avbildning och molekylärbiologisk experiments. Effektiv isolering ger ungefär 10 4 celler per ett hjärta med över 90% renhet.
Musmodeller av olika kardiovaskulära sjukdomar och ämnesomsättningssjukdomar bära fysiologiska och molekylära förändringar som är liknande de som finns hos patienter. Dessutom är genetisk förändring av möss ett kraftfullt verktyg som gör det möjligt för oss att undersöka den patogena roll specifika gener i utvecklingen och utvecklingen av sjukdomar. Numera celltyp-specifik gen-knock-in eller -out möss lätt bildas i många laboratorier och mätningen av mRNA och proteinnivåer i specifika celltyper är det första steget vid bestämning av huruvida mössen verkligen genetiskt modifierade.
Endotel är ett tunt enda skikt av endotelceller (ECS) som linjer inre kärlväggen. Endotelceller spelar en avgörande roll i regleringen av vaskulär spänning, vaskulär permeabilitet och ny kärlbildning 1,2. Endoteldysfunktion är ett kännetecken för många patologiska tillstånd och förändringar i endotelfunktion kan leda till olika bildiovascular sjukdomar 3,4. Det är sålunda betydelsefullt att studera funktionen av endotelceller under fysiologiska och patofysiologiska tillstånd.
Det finns flera sätt att isolera EC 08/05 och isoleringsmetoden måste optimeras beroende på vilken vävnader och arter kommer att användas. Detta beror på att EC från olika vävnader uppvisar en hög nivå av heterogenitet med avseende på deras ytmarkörer och proteinuttryck 9. Framgångsrik isolering av endotelceller kan ofta vara svårt och kräver en viss grad av utbildning och praktik. En gång uppnåtts, metoden av isolering som föreslås i detta protokoll visar sig vara stabil och effektiv.
Det övergripande målet med denna metod är att få mus krans EC (MCECs) av hög kvalitet och kvantitet. Även om den mängd av celler som samlats in från ett hjärta är mindre än celler som samlats in från andra vävnader med hjälp av andra tekniker, ger denna teknik fortfarande satsningter kvalitet. Renheten av endotelceller i den resulterande populationen är större än 90%. Således skulle denna teknik vara perfekt för applikationer som är beroende på rent isolerade endotelceller såsom cell imaging.
De mest använda endotelceller i forskning är mänskliga navelvenendotelceller (HUVEC) på grund av deras bekvämlighet och odling. Men en hel del forskning kräver tillgång till en fysiologisk modell uppnås genom isolering av endotelceller från andra specifika organ 10. Endotelceller utgör en mycket liten population av celler i hjärtvävnaden; deras isolering och odling kan visa sig vara mycket svårt.
Det finns tre viktiga steg i detta protokoll. Den första är att spola …
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av bidrag från National Institutes of Health (HL115578 till A. Makino).
BSA | Sigma | A3311-10G | |
EDTA | Fisher | BP120-500 | |
HBSS | Fisher | SH3026801 | |
Hepes | Sigma-Aldrich | H4034-500G | |
Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
D-(+)-Glucose | Sigma | G7021-1KG | |
Sheep anti-rat IgG beads | Life Technologies | F-410L | DynaBeads pan mouse IgG , Thermo Fisher Scientific, cat# 11035 |
Rat anti-mouse PECAM Antibody | BD Pharmigen | 550274 | BD Biosciences |
IFCS | Fisher | SH30072.04 | |
M199 | Fisher | MT10060-CV | |
Dispase (Neutral Protease) | Worthington Biochemical Corp./Fisher | LS02109 | |
Collagenase Type II | Worthington Biochemical Corp./Fisher | LS004176 | |
Glycerol | Fisher | BP381-1 | |
Igepal | Sigma | 13021-50ml | I3021-50 ml |
Phosphatase inhibitor cocktail | Sigma | P0044-1ml | |
Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340-1 ml | |
Heparin | Sigma | H3149-100KU | |
FBS | Fisher/Mediatech | MT35010CV | |
D-Valine | Sigma | V1255-5G | |
EGS | BD | 356006 | Corning |
Penicillin/Streptomycin | Fisher/Mediatech | MT-30-002-Cl | MT-30-002-CI |