מבחני Coculture ללמוד מקרופאג Microglia גירוי של גליובלסטומה הפלישה
Summary
Understanding the malignant behavior of cancer requires creating accurate models of how tumor cells interact with components of the tumor microenvironment, such as macrophages. Here we describe two methods to study glioblastoma cell interaction with tumor associated macrophages and microglia where the effect on glioblastoma invasion is assessed.
Abstract
multiforme Glioblastoma (גליומה IV כיתה) הוא סרטן אדם אגרסיווי מאוד עם חציון הישרדות של אבחנת פוסט 1 שנים. למרות ההבנה המוגברת של אירועים המולקולריים להצמיח גליובלסטומה, סרטן זה עדיין נשאר מאוד עקשן לטיפול קונבנציונלי. כריתה כירורגית של גידולים במוח בדרגה גבוהה היא כמעט ולא להשלים בשל אופי infiltrative ביותר של תאי גליובלסטומה. גישות טיפוליות אשר להחליש פלישת תא גליובלסטומה ולכן היא אופציה אטרקטיבית. המעבדה שלנו ואחרים הראו גידול כי מקרופאגים הקשורים ו microglia (מקרופאגים מוח תושב) לעורר פלישה גליובלסטומה בחום. הפרוטוקול המתואר במאמר זה משמש מודל גליובלסטומה-מקרופאג / microglia אינטראקציה באמצעות מבחני תרבות חוץ גופית. גישה זו יכולה להקל על הפיתוח מאוד ו / או גילוי של תרופות לשבש את התקשורת עם מקרופאגים המאפשר behav הממארת זוIOR. הקמנו שני מבחני פלישת coculture חזקים שבו microglia / מקרופאגים לעורר פלישת תא גליומה ידי 5 – פי 10. תאי גליובלסטומה שסומנו בסמן פלורסנט או constitutively לבטא חלבון פלואורסצנטי הם מצופים בלי ועם מקרופאגים / microglia על מוסיף קאמרי פוליקרבונט מצופית מטריצה או מוטבע במטריצה תלת ממדים. פלישת תא נבחנת באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי לתדמית ולספור רק תאים פולשני על החלק התחתון של המסנן. באמצעות מבחנים אלה, כמה מעכבים תרופתיים (JNJ-28,312,141, PLX3397, gefitinib, ו Semapimod), זוהה חוסמות מקרופאג / microglia מגורה פלישת גליובלסטומה.
Introduction
Multiforme Glioblastoma הוא סרטן המוח אנושי אגרסיווי עם הישרדות ממוצעת של כ 12 חודשים מרגע האבחון 1,2. גליובלסטומה הוא אחד מסוגי הסרטן הקטלני ביותר קליני מאתגר כפי שהוא עקשן כדי טיפול כימותרפי סטנדרטי, כריתה כירורגית. האופי המפוזר של גליובלסטומה מאפשר לתאי גידול להתפשט בכל רחבי המוח הנורמלי מה שהופך את הגידול המתקדם כמעט בלתי אפשרי בניתוח לכרות לחלוטין. היבט פולשני מאוד זוהי תכונת סימן היכר של גליובלסטומה ו astrocytomas המתקדמת אחרת. לכן, ההתמקדות של מחקר רב כבר על המנגנון המולקולרי של פלישת תא גליובלסטומה. במיקרו-סביבה של הגידול גליובלסטומה משחק תפקידים חיוניים בהקמת ממאירות 3-6. גידול הקשורים מקרופאגים / microglia הוצגו להיות אחראים לקידום הפלישה גליובלסטומה 7,8. רוב המחקרים האלה ככל שיהיו השפעת מקרופאגים / microglia באמצעותמבחנים שמפרידים אותם פיזית מתאי גליובלסטומה. המעבדה שלנו יצאה ליצור מבחני משופרת אשר מאפשרים לנו ללמוד כיצד פלישת גליובלסטומה תלויה מקרופאגים / microglia ב cocultures ומאפשרים לנו תמונת האינטראקציה הפיסית ביניהם במהלך פלישה.
מבחנים קלסיים למדוד פלישת תא כוללת את פורמטים "הסטנדרטית" chemotaxis הקאמרית בוידן ו chemoinvasion. הנה התאים להיחקר הם מצופים בתא פלסטיק המכיל מסנן פוליקרבונט על הקרקעית כי יש נקבוביות של גודל שצוין (בדרך כלל בין 0.4 ו -8 מיקרומטר קוטר). תהליך פלישת תא כרוך מכשול פיזי, בדרך כלל מורכב חלבון תאי מטריקס. ב assay chemoinvasion, המטריצה העדיפו להשתמש הוא Matrigel (להלן המכונה "מטריקס"), תערובת חלבון תאי מטריקס מופרש על ידי Engelbreth-הולם-נחיל (EHS) תאי סרקומה העכבר מורכב בעיקרו של colIV ו laminin סוג Lagen. התאים ממוקמים אז באר בתרבית רקמה המכיל תקשורת תרבית תאים עם או בלי גורמי גדילה נחשדים לעורר פלישה. תאים אשר בעל קיבולת פולשנית גבוהה תפלוש דרך המסנן צופה מטריקס בתדר גבוה לדבוק התחתון של המסנן. יש לנו שונה assay זה כדי להעריך את התפקיד של המיקרוגליה מקרופאגים גידולים הקשורים על פלישת תא גליובלסטומה.
הצלחנו לקבוע באמצעות מבחני coculture תארו בתוך נייר זה כי microglia יכול לעורר את הפלישה של שורות תאי שתי גליובלסטומה ידי 5 – 10 לקפל 9,10. זה משקף את מה שנצפה בבעלי חיים של גליובלסטומה. יתר על כן, פתחנו assay פלישה תלת ממדים שבו האינטראקציות בין תאי גליובלסטומה מקרופאגים / microglia ניתן לבדוק באופן ישיר יותר. היקף הפלישה תא גליובלסטומה מגורה על ידי macrophaGES / microglia ב assay 3D ניתן להשוות מה נתפס בגישה הקאמרית מצופה מטריקס. מבחנים דומים פותחו בעבר כדי לחקור אינטראקציות סרטן השד עם מקרופאגים במהלך הפלישה 11-13. שתי השיטות שתוארו במאמר זה אמור לסייע ביכולת לנתח את המנגנון המולקולרי (ים) של הפלישה מקרופאג / מגורה microglia של תאי גליובלסטומה.
Protocol
Representative Results
Discussion
האופי פולשני מאוד של astrocytomas הגבוהה כיתה ו גליובלסטומה לעשות סרטן המוח אלה קטלניים מאוד. לכן יש חשיבות עליונה להבין את המנגנונים המולקולריים ו הסלולר של פלישת גליובלסטומה. רבות כבר למדו על תהליך הפלישה גליובלסטומה כבר 17. באמצעות פורמטי assay המפורטים במאמר זה, המע…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Dr. Konstantin Dobrenis for providing murine microglia for these studies.
Materials
| Corning BioCoat Matrigel Invasion Chamber: With BD Matrigel Matrix | Corning/Fisher Scientific | Cat: 354481 | |
| Macrophage Serum Free Media (MSFM) (500 ml) | Life Technologies | 12065-074 | |
| CellTracker Red CMTPX Dye | Life Technologies/Molecular Probes | C34552 | |
| CellTracker Green CMFDA Dye | Life Technologies/Molecular Probes | C2925 | |
| GL261 cell line | National Cancer Institute (NCI) | ||
| U87 cell line | American Tissue Type Culture Collection | HTB-14 | |
| THP-1 cell line | American Tissue Type Culture Collection | ATCC TIB-202 | |
| RPMI 1640 Medium (500 ml) | Life Technologies/Gibco | 11875-093 | |
| Formaldehyde solution | Sigma Aldrich | F1635 | |
| Corning Transwell polycarbonate membrane cell culture inserts (8 µM pore) 48 per pack. | Corning | CLS3422 | |
| Cultrex 3-D Culture Matrix Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, PathClear | Trevigen | 3445-005-01 | |
| Fetal Calf Serum (FBS) | Life Technologies | Cat: 10500064 | |
| Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated | Fisherscientific | BP1600-100 | |
| 0.5M EDTA | ThermoFisher Scientific | 15575-020 | |
| phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma Aldrich | P8139-1MG |
Riferimenti
- Buckner, J. C., et al. Central nervous system tumors. Mayo Clin Proc. 82 (10), 1271-1286 (2007).
- Furnari, F. B., et al. Malignant astrocytic glioma: genetics, biology, and paths to treatment. Genes. Dev. 21 (21), 2683-2710 (2007).
- Charles, N. A., Holland, E. C., Gilbertson, R., Glass, R., Kettenmann, H. The brain tumor microenvironment. Glia. 60 (3), 502-514 (2012).
- Li, W., Graeber, M. B. The molecular profile of microglia under the influence of glioma. Neuro. Oncol. 14 (8), 958-978 (2012).
- Watters, J. J., Schartner, J. M., Badie, B. Microglia function in brain tumors. J. Neurosci. Res. 81 (3), 447-455 (2005).
- Zhai, H., Heppner, F. L., Tsirka, S. E. Microglia/macrophages promote glioma progression. Glia. 59 (3), 472-485 (2011).
- Bettinger, I., Thanos, S., Paulus, W. Microglia promote glioma migration. Acta Neuropathol. 103 (4), 351-355 (2002).
- Wesolowska, A., et al. Microglia-derived TGF-beta as an important regulator of glioblastoma invasion: an inhibition of TGF-beta-dependent effects by shRNA against human TGF-beta type II receptor. Oncogene. 27 (7), 918-930 (2008).
- Coniglio, S. J., et al. Microglial stimulation of glioblastoma invasion involves epidermal growth factor receptor (EGFR) and colony stimulating factor 1 receptor (CSF-1R) signaling. Mol Med. 18, 519-527 (2012).
- Miller, I. S., et al. Semapimod sensitizes glioblastoma tumors to ionizing radiation by targeting microglia. PLoS One. 9 (5), (2014).
- Goswami, S., et al. Macrophages promote the invasion of breast carcinoma cells via a colony-stimulating factor-1/epidermal growth factor paracrine loop. Cancer Res. 65 (12), 5278-5283 (2005).
- House, R. P., et al. Two functional S100A4 monomers are necessary for regulating nonmuscle myosin-IIA and HCT116 cell invasion. Biochimica. 50 (32), 6920-6932 (2011).
- Wang, W., et al. The activity status of cofilin is directly related to invasion, intravasation, and metastasis of mammary tumors. J Cell Biol. 173 (3), 395-404 (2006).
- Zagzag, D. 1., Miller, D. C., Chiriboga, L., Yee, H., Newcomb, E. W. Green fluorescent protein immunohistochemistry as a novel experimental tool for the detection of glioma cell invasion in vivo. Brain Pathol. 13 (1), 34-37 (2003).
- Tsuchiya, S., et al. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). Int. J. Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).
- Dobrenis, K. Microglia in cell culture and in transplantation therapy for central nervous system disease. Methods. 16 (3), 320-344 (1998).
- Coniglio, S. J., Segall, J. E. Molecular mechanism of microglia stimulated glioblastoma invasion. Matrix Biol. 32 (7-8), 372-380 (2013).
- See, A. P., Parker, J. J., Waziri, A. The role of regulatory T cells and microglia in glioblastoma-associated immunosuppression. J Neurooncol. 123 (3), 405-412 (2015).
