共培養アッセイは、神経膠芽腫の浸潤のマクロファージとミクログリアの刺激を研究します
Summary
Understanding the malignant behavior of cancer requires creating accurate models of how tumor cells interact with components of the tumor microenvironment, such as macrophages. Here we describe two methods to study glioblastoma cell interaction with tumor associated macrophages and microglia where the effect on glioblastoma invasion is assessed.
Abstract
多形性膠芽腫（グレードIVの神経膠腫）は、1年後の診断の生存期間中央値と非常に攻撃的なヒトの癌です。膠芽腫を引き起こす分子事象の増加の理解にもかかわらず、この癌は、依然として従来の治療に非常に難治性のままです。ハイグレードの脳腫瘍の外科的切除が原因で神経膠芽腫細胞の高度に浸潤性のためまれに完了です。したがって、神経膠芽腫細胞の浸潤を減衰させる治療的アプローチは魅力的な選択肢です。私たちの研究室や他の人は、腫瘍関連マクロファージとミクログリア（常駐脳マクロファージ）が強く、神経膠芽腫の浸潤を刺激することが示されています。この論文に記載されたプロトコルは、インビトロ培養アッセイを使用して、神経膠芽腫、マクロファージ/ミクログリアの相互作用をモデル化するために使用されます。このアプローチは、大幅にこの悪性behavを可能にマクロファージとの通信を妨害する薬剤の開発および/または検出を容易にすることができますIOR。 10倍 – 私たちは、ミクログリア/マクロファージは5によって神経膠腫細胞の浸潤を刺激する2堅牢な共培養浸潤アッセイを確立しています。蛍光タンパク質を発現する構成的に蛍光マーカーで標識された、または神経膠芽腫細胞は、マトリックスでコーティングされたポリカーボネートチャンバーインサートのマクロファージ/ミクログリアなしとでめっきまたは三次元マトリックス中に埋め込まれています。細胞浸潤は、フィルターの下側にのみ侵襲性の細胞画像に蛍光顕微鏡を用いてカウントすることによって評価されます。これらのアッセイを使用して、いくつかの薬理学的阻害剤（JNJ-28312141、PLX3397、ゲフィチニブ、およびSemapimod）は、マクロファージ/ミクログリアが神経膠芽腫の浸潤を刺激ブロックが同定されています。
Introduction
多形性膠芽腫は診断1,2時から約12ヶ月の生存期間中央値との積極的な人間の脳の癌です。神経膠芽腫は、それが標準的な化学療法と外科的切除に不応性であるとして最も致命的と臨床的に挑戦的な癌の一つです。神経膠芽腫のびまん性の性質は、外科的に完全に切除するために高度な腫瘍が事実上不可能に正常な脳全体に拡散するために、腫瘍細胞を可能にします。この高度に侵襲性の側面は、神経膠芽腫およびその他の高度な星細胞腫の顕著な特徴です。そのため、多くの研究の焦点は、神経膠芽腫細胞浸潤の分子機構にされています。神経膠芽腫腫瘍微小環境は、悪性腫瘍3-6の確立に重要な役割を果たしています。腫瘍関連マクロファージ/ミクログリアは、神経膠芽腫の浸潤7,8の促進に関与することが示されました。これらの研究のほとんどは、しかし、使用したマクロファージ/ミクログリアの効果を測定しました物理的に神経膠芽腫細胞からそれらを分離アッセイ。私たちの研究室では、私たちは、神経膠芽腫の浸潤は共培養中のマクロファージ/ミクログリアに依存し、どのように勉強し、画像に侵攻時にそれらの間の物理的相互作用を、私たちを有効にすることを可能にする改良されたアッセイを生成するために着手しました。
細胞浸潤を測定するための古典的なアッセイは、「標準」ボイデンチャンバー走化性および化学浸潤形式を含みます。ここで検討されるべき細胞は、（一般的に、直径が0.4と8μMの間で）指定したサイズの孔を有する底部にポリカーボネートフィルターが含まれているプラスチック製のチャンバー内にめっきされます。細胞浸潤のプロセスは、通常、細胞外マトリックスタンパク質からなる物理的なバリアを含みます。化学浸潤アッセイにおいて、使用される好ましいマトリックスは、細胞外マトリックスタンパク質の混合物を、エンゲル-Holm-Swarm（EHS）マウス肉腫細胞によるマトリゲル（以下、「マトリックス」と呼ばれる）分泌され、COLの大部分から成りラゲンIV型及びラミニン。チャンバは次に浸潤を刺激することが疑われる成長因子の有無にかかわらず、細胞培養培地を含有する組織培養ウェル内に配置されています。高い浸潤能を有する細胞は、より高い周波数での細胞外マトリックスコーティングされたフィルタを介して侵入し、フィルターの下面に付着します。我々は、神経膠芽腫細胞の浸潤に対するミクログリアおよび腫瘍関連マクロファージの役割を評価するために、このアッセイを変更しました。
10倍9,10 -私たちは、ミクログリアが5で2神経膠芽腫細胞株の浸潤を刺激することができる。この論文の中に記載の共培養アッセイを用いて決定することができました。これは、神経膠芽腫の動物モデルで観察されたものが反映されます。さらに、我々は、神経膠芽腫細胞とマクロファージの間の相互作用/ミクログリアは、より直接的に調べることができる3次元浸潤アッセイを開発しました。 macrophaによって刺激神経膠芽腫細胞浸潤の程度3DアッセイにおけるGES /ミクログリアは、マトリックスコーティングされたチャンバーアプローチを用いて見られるものに匹敵します。同様のアッセイは、以前に侵攻11-13時のマクロファージと乳癌の相互作用を研究するために開発されました。このホワイトペーパーで説明する両方の方法は、神経膠芽腫細胞のマクロファージ/ミクログリア刺激された侵入の分子機構（s）を解剖する能力に役立つはずです。
Protocol
Representative Results
Discussion
ハイグレード星細胞腫と神経膠芽腫の高度に侵襲性の性質は、これらの脳の癌は非常に致命的な作り。これは、神経膠芽腫の浸潤の分子・細胞メカニズムを理解することが最も重要です。多くはすでに17神経膠芽腫の浸潤のプロセスについて学習しました。 10倍 – 本論文で詳述アッセイフォーマットを使用して、私たちの研究室では、マウスおよび腫瘍関連マクロファージは5で神経?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Dr. Konstantin Dobrenis for providing murine microglia for these studies.
Materials
| Corning BioCoat Matrigel Invasion Chamber: With BD Matrigel Matrix | Corning/Fisher Scientific | Cat: 354481 | |
| Macrophage Serum Free Media (MSFM) (500 ml) | Life Technologies | 12065-074 | |
| CellTracker Red CMTPX Dye | Life Technologies/Molecular Probes | C34552 | |
| CellTracker Green CMFDA Dye | Life Technologies/Molecular Probes | C2925 | |
| GL261 cell line | National Cancer Institute (NCI) | ||
| U87 cell line | American Tissue Type Culture Collection | HTB-14 | |
| THP-1 cell line | American Tissue Type Culture Collection | ATCC TIB-202 | |
| RPMI 1640 Medium (500 ml) | Life Technologies/Gibco | 11875-093 | |
| Formaldehyde solution | Sigma Aldrich | F1635 | |
| Corning Transwell polycarbonate membrane cell culture inserts (8 µM pore) 48 per pack. | Corning | CLS3422 | |
| Cultrex 3-D Culture Matrix Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, PathClear | Trevigen | 3445-005-01 | |
| Fetal Calf Serum (FBS) | Life Technologies | Cat: 10500064 | |
| Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated | Fisherscientific | BP1600-100 | |
| 0.5M EDTA | ThermoFisher Scientific | 15575-020 | |
| phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma Aldrich | P8139-1MG |
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