Coculture Analyser å studere macrophage og Microglia Stimulering av Glioblastoma Invasion
Summary
Understanding the malignant behavior of cancer requires creating accurate models of how tumor cells interact with components of the tumor microenvironment, such as macrophages. Here we describe two methods to study glioblastoma cell interaction with tumor associated macrophages and microglia where the effect on glioblastoma invasion is assessed.
Abstract
Glioblastoma multiforme (grad IV gliomer) er en svært aggressiv kreft hos mennesker med en median overlevelse på ett år etter diagnose. Til tross for økt forståelse for de molekylære hendelser som gir opphav til glioblastomas, fortsatt denne kreftformen svært motstandsdyktig for konvensjonell behandling. Kirurgisk reseksjon av hjernesvulster høy klasse er sjelden fullstendig på grunn av den svært infiltrerende natur glioblastom celler. Terapeutiske tilnærminger som demper glioblastom celle invasjon er derfor et attraktivt alternativ. Vårt laboratorium og andre har vist at tumor assosiert makrofager og microglia (bosatt hjernemakrofager) sterkt stimulere glioblastom invasjon. Protokollen som er beskrevet i dette dokumentet brukes til å modellere glioblastom-makrofag / mikroglia interaksjon ved hjelp av in vitro kulturanalyser. Denne tilnærmingen kan i stor grad legge til rette for utvikling og / eller funn av narkotika som forstyrrer kommunikasjonen med makrofagene som gjør at dette ondartet Behavior. Vi har etablert to robuste coculture invasjon analyser hvor microglia / makrofager stimulerer glioma celle invasjon av 5-10 ganger. Glioblastom celler merket med et fluoriserende fargestoff eller som konstitutivt uttrykker et fluorescent protein er belagt uten og med makrofager / mikroglia på matrise-belagt polykarbonat kammerinnsatser eller innleiret i en tredimensjonal matrise. Celle invasjon bestemmes ved hjelp av fluorescens mikroskopi av bildet og telle bare invaderende celler på undersiden av filteret. Ved hjelp av disse analysene, flere farmakologiske hemmere (JNJ-28312141, PLX3397, Gefitinib, og Semapimod), har blitt identifisert som blokkerer makrofag / microglia stimulert glioblastom invasjon.
Introduction
Glioblastoma multiforme er en aggressiv menneskelige hjernekreft med en median overlevelse på ca 12 måneder fra tidspunktet for diagnosen 1,2. Glioblastom er en av de mest dødelige og klinisk utfordrende kreft som det ikke kan behandles med standard kjemoterapi og kirurgisk reseksjon. Den diffuse natur glioblastom gjør kreftceller sprer seg i hele normal hjerne gjør avansert tumor praktisk talt umulig å kirurgisk resect helt. Denne svært invasiv aspektet er et kjennetegn trekk ved glioblastom og andre avanserte astrocytomas. Derfor har fokuset for mye forskning vært på den molekylære mekanismen for glioblastom celle invasjon. Den glioblastom svulsten mikromiljøet spiller viktige roller i å etablere malignitet 3-6. Tumorassosierte makrofager / microglia ble vist å være ansvarlig for å fremme glioblastom invasjon 7,8. De fleste av disse studiene imidlertid målt effekt av makrofager / mikroglia ved hjelpanalyser som fysisk skiller dem fra glioblastom celler. Vårt laboratorium har satt ut for å generere bedre analyser som tillater oss å studere hvordan glioblastom invasjon er avhengig av makrofager / microglia i cocultures og gjøre oss i stand til å avbilde fysisk interaksjon mellom dem under invasjonen.
Klassiske analyser for å måle celle invasjon inkludere "standard" Boyden kammer kjemotakse og chemoinvasion formater. Her cellene som skal studeres blir sådd ut i en plastkammer som inneholder et polykarbonatfilter i bunnen som har porer med en bestemt størrelse (generelt mellom 0,4 og 8 um i diameter). Prosessen med celle invasjon innebærer en fysisk barriere, vanligvis sammensatt av ekstracellulær matriks protein. I chemoinvasion assay er den foretrukne matrisen som anvendes er Matrigel (heretter referert til som "matrise"), en ekstracellulær matriks proteinblanding som utskilles av Engelbreth-Holm-sverm (HMS) mus sarkomceller og består i hovedsak av collagen type IV og laminin. Kamrene blir deretter plassert i en vevskultur vel som inneholder cellekulturmedium med eller uten vekstfaktorer som er mistenkt for å stimulere invasjon. Celler som har en høyere kapasitet invasiv skal trenge gjennom den ekstracellulære matriks belagt filter ved en høyere frekvens og holder seg til undersiden av filteret. Vi har endret dette assay for å vurdere rollen til mikroglia og tumorassosierte makrofager på glioblastoma celle invasjon.
Vi har vært i stand til å bestemme ved hjelp av coculture testene beskrevet i dette papir som mikroglia kan stimulere invasjonen av to glioblastoma cellelinjer ved 5 – 10 ganger 9,10. Dette skyldes hva som er observert i dyremodeller av glioblastom. Videre har vi utviklet en tredimensjonal invasjon analysen hvor samspillet mellom glioblastom celler og makrofager / microglia kan undersøkes mer direkte. Omfanget av glioblastom celle invasjon stimuleres av macrophages / mikroglia i 3D-analysen er sammenlignbare med det som er sett ved hjelp av matrisen belagt kammeret tilnærming. Lignende analyser ble tidligere utviklet for å studere brystkreft interaksjoner med makrofager under invasjonen 11-13. Begge metodene er beskrevet i dette dokumentet skal hjelpe til med evnen til å dissekere den molekylære mekanisme (r) for makrofag / mikroglia-stimulert invasjon av glioblastom celler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den svært invasiv art høy klasse astrocytomas og glioblastom gjøre disse hjernen kreft svært dødelig. Det er derfor av avgjørende betydning for å forstå de molekylære og cellulære mekanismer for glioblastom invasjon. Mye har blitt lært om prosessen med glioblastom invasjon allerede 17. Bruk av analyseformater er beskrevet i denne artikkelen, har vårt laboratorium vist i både mus og menneskelige modeller som tumorassosierte makrofager kan stimulere glioma celle invasjon av 5-10 ganger. Dette cocul…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Dr. Konstantin Dobrenis for providing murine microglia for these studies.
Materials
| Corning BioCoat Matrigel Invasion Chamber: With BD Matrigel Matrix | Corning/Fisher Scientific | Cat: 354481 | |
| Macrophage Serum Free Media (MSFM) (500 ml) | Life Technologies | 12065-074 | |
| CellTracker Red CMTPX Dye | Life Technologies/Molecular Probes | C34552 | |
| CellTracker Green CMFDA Dye | Life Technologies/Molecular Probes | C2925 | |
| GL261 cell line | National Cancer Institute (NCI) | ||
| U87 cell line | American Tissue Type Culture Collection | HTB-14 | |
| THP-1 cell line | American Tissue Type Culture Collection | ATCC TIB-202 | |
| RPMI 1640 Medium (500 ml) | Life Technologies/Gibco | 11875-093 | |
| Formaldehyde solution | Sigma Aldrich | F1635 | |
| Corning Transwell polycarbonate membrane cell culture inserts (8 µM pore) 48 per pack. | Corning | CLS3422 | |
| Cultrex 3-D Culture Matrix Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, PathClear | Trevigen | 3445-005-01 | |
| Fetal Calf Serum (FBS) | Life Technologies | Cat: 10500064 | |
| Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated | Fisherscientific | BP1600-100 | |
| 0.5M EDTA | ThermoFisher Scientific | 15575-020 | |
| phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma Aldrich | P8139-1MG |
Riferimenti
- Buckner, J. C., et al. Central nervous system tumors. Mayo Clin Proc. 82 (10), 1271-1286 (2007).
- Furnari, F. B., et al. Malignant astrocytic glioma: genetics, biology, and paths to treatment. Genes. Dev. 21 (21), 2683-2710 (2007).
- Charles, N. A., Holland, E. C., Gilbertson, R., Glass, R., Kettenmann, H. The brain tumor microenvironment. Glia. 60 (3), 502-514 (2012).
- Li, W., Graeber, M. B. The molecular profile of microglia under the influence of glioma. Neuro. Oncol. 14 (8), 958-978 (2012).
- Watters, J. J., Schartner, J. M., Badie, B. Microglia function in brain tumors. J. Neurosci. Res. 81 (3), 447-455 (2005).
- Zhai, H., Heppner, F. L., Tsirka, S. E. Microglia/macrophages promote glioma progression. Glia. 59 (3), 472-485 (2011).
- Bettinger, I., Thanos, S., Paulus, W. Microglia promote glioma migration. Acta Neuropathol. 103 (4), 351-355 (2002).
- Wesolowska, A., et al. Microglia-derived TGF-beta as an important regulator of glioblastoma invasion: an inhibition of TGF-beta-dependent effects by shRNA against human TGF-beta type II receptor. Oncogene. 27 (7), 918-930 (2008).
- Coniglio, S. J., et al. Microglial stimulation of glioblastoma invasion involves epidermal growth factor receptor (EGFR) and colony stimulating factor 1 receptor (CSF-1R) signaling. Mol Med. 18, 519-527 (2012).
- Miller, I. S., et al. Semapimod sensitizes glioblastoma tumors to ionizing radiation by targeting microglia. PLoS One. 9 (5), (2014).
- Goswami, S., et al. Macrophages promote the invasion of breast carcinoma cells via a colony-stimulating factor-1/epidermal growth factor paracrine loop. Cancer Res. 65 (12), 5278-5283 (2005).
- House, R. P., et al. Two functional S100A4 monomers are necessary for regulating nonmuscle myosin-IIA and HCT116 cell invasion. Biochimica. 50 (32), 6920-6932 (2011).
- Wang, W., et al. The activity status of cofilin is directly related to invasion, intravasation, and metastasis of mammary tumors. J Cell Biol. 173 (3), 395-404 (2006).
- Zagzag, D. 1., Miller, D. C., Chiriboga, L., Yee, H., Newcomb, E. W. Green fluorescent protein immunohistochemistry as a novel experimental tool for the detection of glioma cell invasion in vivo. Brain Pathol. 13 (1), 34-37 (2003).
- Tsuchiya, S., et al. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). Int. J. Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).
- Dobrenis, K. Microglia in cell culture and in transplantation therapy for central nervous system disease. Methods. 16 (3), 320-344 (1998).
- Coniglio, S. J., Segall, J. E. Molecular mechanism of microglia stimulated glioblastoma invasion. Matrix Biol. 32 (7-8), 372-380 (2013).
- See, A. P., Parker, J. J., Waziri, A. The role of regulatory T cells and microglia in glioblastoma-associated immunosuppression. J Neurooncol. 123 (3), 405-412 (2015).
