Сокультивирования Анализы по изучению макрофагами и микроглии стимуляции глиобластомы вторжения
Summary
Understanding the malignant behavior of cancer requires creating accurate models of how tumor cells interact with components of the tumor microenvironment, such as macrophages. Here we describe two methods to study glioblastoma cell interaction with tumor associated macrophages and microglia where the effect on glioblastoma invasion is assessed.
Abstract
Глиобластомы мультиформная (класс IV глиомы) является очень агрессивным человеком рак с медианой выживаемости 1 года после установления диагноза. Несмотря на повышенное понимание молекулярных событий, которые приводят к возникновению глиобластомы, этот рак все еще остается крайне невосприимчивы к обычному лечению. Хирургическая резекция опухолей головного мозга высокого класса редко бывает полным из-за высокой инфильтративного характера клеток глиобластомы. Поэтому терапевтические подходы, которые вытягивают инвазию клеток глиобластомы является привлекательным вариантом. Наша лаборатория и другие показали, что ассоциированные с опухолью макрофаги и микроглии (резидентные макрофаги мозга) сильно стимулируют глиобластомы вторжение. Протокол , описанный в этой статье , используется для моделирования глиобластомы-макрофагами / микроглии взаимодействия с использованием анализов культуры в пробирке. Такой подход может в значительной степени способствовать развитию и / или обнаружения наркотиков, которые нарушают связь с макрофагами, которая позволяет эту злокачественную BehavIOR. Мы установили два надежных вторжения Совместное культивирование анализов, где микроглии / макрофаги стимулируют вторжение глиомы клеток на 5 – 10 раз. Клетки глиобластомы, меченные флуоресцентным маркером или конститутивно экспрессирующих флуоресцентный белок высевают без и с макрофагами / микроглии на матричных покрытием из поликарбоната камерных вкладышей или внедренный в трехмерной матрице. Инвазии клеток оценивают с помощью флуоресцентной микроскопии для изображения и рассчитывать только инвазивные клетки на нижней стороне фильтра. С помощью этих анализов, несколько фармакологических ингибиторов (JNJ-28312141, PLX3397, Гефитиниб и Semapimod), были идентифицированы, которые блокируют макрофаги / микроглия стимулировали глиобластомы вторжение.
Introduction
Глиобластомы мультиформная является агрессивным человеком рак мозга с медиана выживаемости составляет приблизительно 12 месяцев с момента постановки диагноза 1,2. Глиобластома является одним из самых опасных и клинически сложных видов рака, как она резистентной к стандартной химиотерапии и хирургической резекции. Диффузный характер глиобластомы позволяет опухолевым клеткам распространяться по всему нормальному мозгу, делая запущенная опухоль практически невозможно хирургическим резекцию полностью. Это очень инвазивные аспект является отличительной чертой глиобластомы и других продвинутых астроцитомах. Таким образом, в центре внимания многих исследований было на молекулярном механизме вторжения клеток глиобластомы. Микроокружение опухоли глиобластомы играет жизненно важную роль в установлении злокачественности 3-6. Ассоциированных с опухолью макрофаги / микроглия Было показано , что отвечать за содействие глиобластомы вторжения 7,8. Большинство из этих исследований, однако, измерили влияние макрофагов / микроглии с использованиемАнализы, которые физически отделить их от клеток глиобластомы. Наша лаборатория установила, чтобы произвести улучшенные анализы, которые позволяют нам изучить, как глиобластомы вторжение зависит от макрофагах / микроглии в совместных культурах и позволяют изображению физического взаимодействия между ними во время вторжения.
Классические анализы для измерения вторжения клеток включают "стандартные" Бойден камеры хемотаксис и форматы chemoinvasion. Здесь клетки должны быть изучены высевают в пластиковой камере, которая содержит поликарбонатный фильтр на дне, который имеет поры определенного размера (как правило, от 0,4 до 8 мкм в диаметре). Процесс инвазии клеток включает физический барьер, как правило, состоит из внеклеточного матрикса белка. В анализе chemoinvasion, предпочтительной является матрица, используемая Матригель (далее именуемые как "матрица"), внеклеточный смесь матричный белок, выделяемый Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) мыши клетки саркомы и состоит в основном из седловинеLagen типа IV и ламинин. Камеры затем помещают в культуральную лунку ткани, которая содержит среды для культивирования клеток с или без факторов роста, которые, как предполагается, стимулируют инвазию. Клетки, которые имеют более высокую инвазивную способность вторгнется через фильтр внеклеточной матрицы с покрытием на более высокой частоте, и прилипают к нижней стороне фильтра. Мы модифицировали этот анализ, чтобы оценить роль микроглии и макрофагов, ассоциированных с опухолью инвазии клеток глиобластомы.
Нам удалось определить с помощью анализов , описанных сокультивирования в этой статье , что микроглии может стимулировать вторжение двух глиобластомы клеточных линий на 5 – 10 раз 9,10. Это отражает то, что наблюдается в животных моделях глиобластомы. Кроме того, мы разработали анализ трехмерную инвазии, где взаимодействие между глиобластомы клеток и макрофагов / микроглии могут быть рассмотрены более непосредственно. Степень инвазии клеток глиобластомы стимулируется macrophaGES / микроглии в 3D-пробы сравнима с тем, что наблюдается с использованием матрицы с покрытием камеры подход. Аналогичные анализы были ранее разработаны для изучения карциномы молочной железы взаимодействия с макрофагами во время вторжения 11-13. Оба описанных в данной работе методы должны помочь в способности рассекать молекулярный механизм (ы) макрофагами / микроглии-стимулированной вторжения клеток глиобластомы.
Protocol
Representative Results
Discussion
Высоко инвазивный характер высоких астроцитомах класса и глиобластомы делают эти виды рака мозга очень смертельным. Поэтому крайне важно, чтобы это понять молекулярные и клеточные механизмы глиобластомы вторжения. Многое узнал о процессе глиобластомы вторжения уже 17. С помощью…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Dr. Konstantin Dobrenis for providing murine microglia for these studies.
Materials
| Corning BioCoat Matrigel Invasion Chamber: With BD Matrigel Matrix | Corning/Fisher Scientific | Cat: 354481 | |
| Macrophage Serum Free Media (MSFM) (500 ml) | Life Technologies | 12065-074 | |
| CellTracker Red CMTPX Dye | Life Technologies/Molecular Probes | C34552 | |
| CellTracker Green CMFDA Dye | Life Technologies/Molecular Probes | C2925 | |
| GL261 cell line | National Cancer Institute (NCI) | ||
| U87 cell line | American Tissue Type Culture Collection | HTB-14 | |
| THP-1 cell line | American Tissue Type Culture Collection | ATCC TIB-202 | |
| RPMI 1640 Medium (500 ml) | Life Technologies/Gibco | 11875-093 | |
| Formaldehyde solution | Sigma Aldrich | F1635 | |
| Corning Transwell polycarbonate membrane cell culture inserts (8 µM pore) 48 per pack. | Corning | CLS3422 | |
| Cultrex 3-D Culture Matrix Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, PathClear | Trevigen | 3445-005-01 | |
| Fetal Calf Serum (FBS) | Life Technologies | Cat: 10500064 | |
| Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated | Fisherscientific | BP1600-100 | |
| 0.5M EDTA | ThermoFisher Scientific | 15575-020 | |
| phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma Aldrich | P8139-1MG |
Riferimenti
- Buckner, J. C., et al. Central nervous system tumors. Mayo Clin Proc. 82 (10), 1271-1286 (2007).
- Furnari, F. B., et al. Malignant astrocytic glioma: genetics, biology, and paths to treatment. Genes. Dev. 21 (21), 2683-2710 (2007).
- Charles, N. A., Holland, E. C., Gilbertson, R., Glass, R., Kettenmann, H. The brain tumor microenvironment. Glia. 60 (3), 502-514 (2012).
- Li, W., Graeber, M. B. The molecular profile of microglia under the influence of glioma. Neuro. Oncol. 14 (8), 958-978 (2012).
- Watters, J. J., Schartner, J. M., Badie, B. Microglia function in brain tumors. J. Neurosci. Res. 81 (3), 447-455 (2005).
- Zhai, H., Heppner, F. L., Tsirka, S. E. Microglia/macrophages promote glioma progression. Glia. 59 (3), 472-485 (2011).
- Bettinger, I., Thanos, S., Paulus, W. Microglia promote glioma migration. Acta Neuropathol. 103 (4), 351-355 (2002).
- Wesolowska, A., et al. Microglia-derived TGF-beta as an important regulator of glioblastoma invasion: an inhibition of TGF-beta-dependent effects by shRNA against human TGF-beta type II receptor. Oncogene. 27 (7), 918-930 (2008).
- Coniglio, S. J., et al. Microglial stimulation of glioblastoma invasion involves epidermal growth factor receptor (EGFR) and colony stimulating factor 1 receptor (CSF-1R) signaling. Mol Med. 18, 519-527 (2012).
- Miller, I. S., et al. Semapimod sensitizes glioblastoma tumors to ionizing radiation by targeting microglia. PLoS One. 9 (5), (2014).
- Goswami, S., et al. Macrophages promote the invasion of breast carcinoma cells via a colony-stimulating factor-1/epidermal growth factor paracrine loop. Cancer Res. 65 (12), 5278-5283 (2005).
- House, R. P., et al. Two functional S100A4 monomers are necessary for regulating nonmuscle myosin-IIA and HCT116 cell invasion. Biochimica. 50 (32), 6920-6932 (2011).
- Wang, W., et al. The activity status of cofilin is directly related to invasion, intravasation, and metastasis of mammary tumors. J Cell Biol. 173 (3), 395-404 (2006).
- Zagzag, D. 1., Miller, D. C., Chiriboga, L., Yee, H., Newcomb, E. W. Green fluorescent protein immunohistochemistry as a novel experimental tool for the detection of glioma cell invasion in vivo. Brain Pathol. 13 (1), 34-37 (2003).
- Tsuchiya, S., et al. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). Int. J. Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).
- Dobrenis, K. Microglia in cell culture and in transplantation therapy for central nervous system disease. Methods. 16 (3), 320-344 (1998).
- Coniglio, S. J., Segall, J. E. Molecular mechanism of microglia stimulated glioblastoma invasion. Matrix Biol. 32 (7-8), 372-380 (2013).
- See, A. P., Parker, J. J., Waziri, A. The role of regulatory T cells and microglia in glioblastoma-associated immunosuppression. J Neurooncol. 123 (3), 405-412 (2015).
