In Vivo Biocapteur Tracks apoptotique non-activité Caspase chez la drosophile
Summary
Pour détecter les cellules saines chez des animaux entiers qui contiennent de faibles niveaux d'activité de la caspase, le biocapteur très sensible désigné CaspaseTracker a été générée pour la drosophile. Biocapteur activité caspase-dépendante est détectée dans les cellules saines longue durée de vie à travers les organes internes des animaux adultes élevés dans des conditions optimisées en l'absence de stimuli de mort.
Abstract
Caspases are the key mediators of apoptotic cell death via their proteolytic activity. When caspases are activated in cells to levels detectable by available technologies, apoptosis is generally assumed to occur shortly thereafter. Caspases can cleave many functional and structural components to cause rapid and complete cell destruction within a few minutes. However, accumulating evidence indicates that in normal healthy cells the same caspases have other functions, presumably at lower enzymatic levels. Studies of non-apoptotic caspase activity have been hampered by difficulties with detecting low levels of caspase activity and with tracking ultimate cell fate in vivo. Here, we illustrate the use of an ultrasensitive caspase reporter, CaspaseTracker, which permanently labels cells that have experienced caspase activity in whole animals. This in vivo dual color CaspaseTracker biosensor for Drosophila melanogaster transiently expresses red fluorescent protein (RFP) to indicate recent or on-going caspase activity, and permanently expresses green fluorescent protein (GFP) in cells that have experienced caspase activity at any time in the past yet did not die. Importantly, this caspase-dependent in vivo biosensor readily reveals the presence of non-apoptotic caspase activity in the tissues of organ systems throughout the adult fly. This is demonstrated using whole mount dissections of individual flies to detect biosensor activity in healthy cells throughout the brain, gut, malpighian tubules, cardia, ovary ducts and other tissues. CaspaseTracker detects non-apoptotic caspase activity in long-lived cells, as biosensor activity is detected in adult neurons and in other tissues at least 10 days after caspase activation. This biosensor serves as an important tool to uncover the roles and molecular mechanisms of non-apoptotic caspase activity in live animals.
Introduction
Les caspases sont des protéases cystéines qui médient la mort cellulaire par apoptose par clivage de nombreuses protéines intracellulaires après les résidus aspartate clés. Par exemple, les caspases initiatrices activent les caspases effectrices, des nucléases d'ADN déréprimer, les composants du cytosquelette cliver et modifient la composition lipidique des membranes cellulaires à démonter rapidement les cellules et stimuler leur reconnaissance et phagocytose par les cellules qui se débarrassent des corps cellulaires voisins. 1-4 On estime que des milliards de cellules meurent par jour dans le corps humain, et l' apoptose est un mécanisme important de la mort des cellules tumorales induite par la chimiothérapie. 5 un ensemble différent de caspases peut provoquer la mort cellulaire par des procédés non-apoptotiques distincts pour stimuler l' immunité innée. 6 par conséquent, la plupart des recherches sur les caspases a mis l'accent sur leurs fonctions pro-mort.
Fait intéressant, la preuve précoce dans le domaine a révélé que les mêmes caspases responsables de la promotion de la mort cellulaire ont aussi non-mort fonctions. Des études pionnières ont démontré que les caspases sont impliqués dans diverses fonctions cellulaires dans les cellules saines, y compris la régulation de la prolifération cellulaire et la migration au cours de l' embryogenèse. 7-9 caspases sont nécessaires pour individualiser spermatid chez la drosophile 10,11, pour bloquer une voie de mort cellulaire nécroptose alternatif chez les souris 12,13, et pour le traitement des microARN en C. . elegans 14,15 Dans peut-être les plus longue durée de vie des cellules, les neurones, les caspases et d' autres machines apoptotique sont impliqués dans la régulation de l' activité neuronale par la taille des terminaisons synaptiques, un processus considéré comme essentiel pour renforcer d' autres synapses pour l' apprentissage et la mémoire 16-. 18 Il est possible que les caspases faciliter l' élagage synaptique par un type de mini-apoptose neuronale de petites saillies , sans mort cellulaire entier. 19 Cependant, les caspases peuvent avoir d' autres fonctions sans rapport avec les événements de l' apoptose analogue. 20,21 double rôles dans la vie et la mort ne sont pas uniques à caspases; BCL-2 protéines de la famille et du cytochrome c ont des rôles en energetique cellulaires dans les cellules saines , mais font également partie de la voie apoptotique de base qui est activé par de nombreux types de stress cellulaire. 22-25 Bien que pas prouvé, il semble logique que l' évolution a lié jour -jobs à mort-emplois dans les mêmes molécules pour assurer l'élimination rapide des cellules impropres ou indésirables.
À l'heure actuelle, les mécanismes moléculaires de l'activité de la caspase non apoptotiques ne sont pas comprises, et le degré d'activité de la caspase non apoptotique pendant le développement embryonnaire et dans les tissus adultes sont également inconnus. Un défi majeur est la difficulté de distinguer jour-emploi de mort-emploi de caspases. Contrairement à l'apoptose et pyroptosis, lorsque l'activité de la caspase est amplifié par une cascade protéolytique, le jour-emploi de caspases devraient se produire beaucoup plus faibles niveaux d'activité enzymatique, probablement ci-dessous la détection par beaucoup techn disponibleslogies.
Avant le travail présenté ici, d'autres ont développé une variété de biocapteurs de caspases à des fins différentes. Les biocapteurs SCAT (par exemple, ECFP-DEVD-Vénus) détectent rapidement l' activité de la caspase en temps réel dans des cellules cultivées et les tissus animaux en utilisant FRET. 26,27 Sur caspase clivage, la GFP fraction nucléaire ciblée de Apoliner (mCD8-RFP-DQVD- nucGFP) subit une re – localisation subcellulaire quelques minutes lorsque sa membrane plasmique attache est clivée par les caspases. 28 de même, ApoAlert-pCaspase3-Sensor (NES-DEVD-YFP-SLN) relocalise du cytosol vers le noyau lors de la caspase clivage. 29,30 Plus récemment, le chromophore dans iCasper est habilement conçu pour émettre une fluorescence lorsqu'il est clivé par des caspases, ce qui permet la détection de l' activité de biodétecteur en temps réel dans les neurones d'embryons de Drosophila, mais surtout en association avec la mort cellulaire développementale. mort 31 caspase-dépendante des neurones olfactifs au cours du vieillissement était demonstévalué par immuno-détection de la forme de biocapteurs CPV (par exemple, mCD8-PARP-Vénus) caspase-clivée. 32,33 Surtout, la forme activée de la caspase-3 a été détectée en l'absence de mort cellulaire par immunocoloration sensible dans les épines de neurones en culture, et dans le soma en utilisant la fluorescence de la caspase-dépendante du nucléaire colorant CellEvent rapporteur, mais des difficultés ont été rencontrées en raison de photo-toxicité, bien que la mort cellulaire a été retardée jusqu'à ce que la colonne vertébrale élimination. 19 Ainsi, de nouveaux biocapteurs de caspases sont nécessaires pour détecter et de suivre les cellules ayant une activité caspase basale in vivo.
Pour surmonter ces difficultés, nous avons généré un roman à double biocapteur couleur de caspase, désigné CaspaseTracker. Cette stratégie combine une version modifiée de la drosophile sensible à la caspase Apoliner biocapteur 28 avec la drosophile G-TRACE système de recombinase 34 FRT pour marquer de manière permanente et le suivi des cellules in vivo. <sup> 35 Le système G-TRACE Gal4 activé permet de très faibles niveaux de caspases pour activer CaspaseTracker, résultant dans l' expression de la DP dans le cytoplasme et l' expression permanente de la GFP nucléaire ciblée dans une cellule qui a jamais connu l' activité de la caspase 35 Ce système peut étiqueter. cellules tout au long de la vie chez les animaux entiers à l' aide de Drosophila melanogaster, un système modèle traitable et largement utilisé pour l'étude des caspases et la mort cellulaire. 36-38
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici, nous illustrons la construction et le fonctionnement interne de CaspaseTracker qui facilitent la détection de l'activité de la caspase base largement répandue dans les tissus sains. Les étapes essentielles pour détecter l' activité de la caspase non-apoptotique in vivo sont: 1) la génération de mouches avec le transgène biocapteur, 2) la vérification de la fonction de rapporteur spécifique-caspase avec des contrôles appropriés, 3) la pratique des techniques de dissection pour observer …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Polan Santos et Darren Obbard pour les illustrations de drosophile en Fig. 2a, Marcelo Jacobs-Lorena pour l'utilisation de l'insectarium JHMRI. Ce travail a été soutenu par la bourse de la Fondation Life Science Research (HLT), Comité des bourses universitaires de Hong Kong AoE / B-07/99 (MCF) et NIH accorde NS096677, NS037402 et NS083373 (JMH). Ho Lam Tang est une fondation Shurl et Kay Curci Fellow de la Fondation de recherche en sciences de la vie.
Materials
| CONSUMABLES AND REAGENTS | |||
| Vectashield | Vector Products | H-1000 | Mounting medium |
| Forceps | Ted Pella | #505 (110mm, #5) | Dumont tweezer biology grade, stainless steel |
| Hanging Drop Slides | Fisher Scientific | 12-565B | Glass slides |
| Hoechst 33342 | Molecular Probes | H1399 | DNA stain |
| Alexa Fluor 633 Phalloidin | Molecular Probes | A22284 | Actin stain |
| Rat-Elav-7E8A10 anti-elav antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | Antibody Registry ID: AB_528218 | Stain for Drosophla pan-neuronal ELAV |
| Cleaved caspase-3 (Asp175) antibody | Cell Signaling Technology | #9661 | Stain for active fragment of caspase-3 |
| ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36934 | to preserve fluorophores |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Life Technologies | P36961 | to preserve fluorophores |
| SylGard 182 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | Product code: 0001023934 | for dissection plates |
| EQUIPMENT | |||
| LSM780 confocal microscope | Carl Zeiss | N/A | Imaging |
| Carl Zeiss Stereomicroscope Stemi 2000 | Carl Zeiss | N/A | Drosophila dissection |
| AmScope Fiber Optic Dual Gooseneck Microscope Illuminator, 150W | AmScope | WBM99316 | Light source |
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