Ontwikkeling van een ethanol-geïnduceerde fibrotische lever Model in zebravis om te studeren Progenitor Cell-gemedieerde Hepatocyt Regeneration
Summary
Sustained fibrosis with deposition of excessive extracellular matrix proteins leads to cirrhosis. Alcohol abuse is one of the main causes of severe liver disease. We established an ethanol-induced zebrafish fibrotic liver model to study the mechanisms and strategies of promoting hepatocyte regeneration upon alcohol-induced injury.
Abstract
Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading to cirrhosis with hepatocellular dysfunction. Among multiple hepatic insults, alcohol abuse can lead to significant health problems including liver failure and hepatocellular carcinoma. Nonetheless, the identity of endogenous cellular sources that regenerate hepatocytes in response to alcohol has not been properly investigated. Moreover, few studies have effectively modeled hepatocyte regeneration upon alcohol-induced injury. We recently reported on establishing an ethanol (EtOH)-induced fibrotic liver model in zebrafish in which hepatic progenitor cells (HPCs) gave rise to hepatocytes upon near-complete hepatocyte loss in the presence of fibrogenic stimulus. Furthermore, through chemical screens using this model, we identified multiple small molecules that enhance hepatocyte regeneration. Here we describe in detail the procedures to develop an EtOH-induced fibrotic liver model and to perform chemical screens using this model in zebrafish. This protocol will be a critical tool to delineate the molecular and cellular mechanisms of how hepatocyte regenerates in the fibrotic liver. Furthermore, these methods will facilitate potential discovery of novel therapeutic strategies for chronic liver disease in vivo.
Introduction
Ondanks de opmerkelijke regeneratiecapaciteit van hepatocyten 1, waarin de belangrijkste parenchymale cel type de lever, chronisch leverfalen belemmert dit vermogen, wat leidt tot hepatische progenitor cellen (HPC) -afhankelijke regeneratie 2.
Chronische leverschade is voornamelijk afkomstig van alcoholmisbruik, chronische hepatitis C virus (HCV) 3 en niet-alcoholische fatty leverziekte (NAFLD) 4. Het leidt tot aanhoudende leverfibrose, die wordt geassocieerd met de accumulatie van extracellulaire matrix (ECM) proteïnen. Aanhoudende ECM accumulatie vervalsen intact hepatische architectuur door vorming van een fibreus littekenweefsel 5 vervolgens resulteert in cirrose met hoge morbiditeit en mortaliteit. Vele pogingen zijn gedaan om de fibrotische respons voornamelijk te beperken door te focussen op profibrogene cytokinen remmen en geactiveerde myofibroblasten 6. Dit laatste is voornamelijk afkomstig van leverstellaatcellen (HSC's), het beginsel lever non-parenchymale cellen die verantwoordelijk zijn voor littekenvorming lever 4. Niettemin regeneratieve therapieën die endogene cellulaire bronnen zoals HPC hepatocyten in aanwezigheid van aanhoudende fibrogenen beledigingen regenereren stimuleren wachten verder onderzoek.
Vele experimentele modellen van leverfibrose beschreven in zoogdieren. Herhaalde injectie van koolstoftetrachloride (CCl4) wordt veel gebruikt om leverfibrose induceren in muis en ratmodellen 7. In combinatie met een hoog vetgehalte (HF) dieet, alcohol leidde tot een aanzienlijke opwaartse regulatie van genexpressie en profibrogene leverfibrose 8. Terwijl steatose (lipide-accumulatie) het gevolg is van acute blootstelling aan alcohol, het maakt de lever gevoelig voor een ernstigere leveraandoening 9.
De zebravis, Danio rerio, heeft ontpopt als een waardevolle gewervelde modelsysteem voor het bestuderen van de regeneratie. hoewelandere lagere gewervelde dieren zoals watersalamanders en axolotls een opmerkelijk vermogen tot regeneratie, de zebravis biedt voordelen boven andere modelsystemen met betrekking tot de genetische manipulatie en visualisatie strategieën worden vastgesteld om potentiële regeneratieve manipuleren factoren 10. De zebravis vertegenwoordigt ook een aantrekkelijk gewervelde model voor het bestuderen van alcoholische leverziekte (ALD) door simpelweg het toevoegen van ethanol (EtOH) om hun water. Acute EtOH blootstelling aan larven en volwassen zebravis veroorzaakt leversteatose 11-13. Bij volwassen zebravissen ontvangen langdurige blootstelling EtOH, werd collageen afzetting waargenomen met opregulatie van fibrose-gerelateerde genen 14. Er bestaat echter behoefte aan het ontwikkelen van modellen leverregeneratie studeren in reactie op EtOH als fibrogenen stimulus.
Onlangs ontwikkelden we een-EtOH-geïnduceerde fibrotische lever model in de zebravis 15. We combineerden een hepatocyt-specifieke genetische ablatie systeem EtOH behandeling larvale en adult zebravis. Genereerden we twee transgene lijnen, Tg (fabp10a: CFP-NTR) GT1 en Tg (fabp10a: mCherry-NTR) GT2, waarbij E. coli nitroreductase (NTR) respectievelijk gefuseerd aan de cyaan en mCherry fluorescerend eiwit, onder toezicht van de hepatocyt-specifieke vetzuurbindend eiwit 10a, lever basis (fabp10a) promoter. In dit systeem zet NTR een toxisch progeneesmiddel metronidazol (MTZ) in een DNA-streng inter-verknopingsmiddel 16 induceren expliciete dood van hepatocyten. Met dit model hebben we aangetoond dat een populatie van levercellen, die reageren op Notch signalering, omgezet in hepatocyten in de bijna afwezigheid van hepatocyten en de overmaat ECM. We wijzen deze cellen als HPCs. Bovendien, door middel van chemische schermen, identificeerden we kleine molecule activatoren van Wnt-signalering en remmers van Notch signalering die levercel regeneratie in de fibrotische lever te vergroten. Therefoopnieuw, onze fibrotische lever model in de zebravis staat voor een uitstekende chemische screening systeem in vergelijking tot cel cultuur- of zoogdieren based screening systeem. Het is een in vivo systeem met aanzienlijke kosten- en tijdbesparende voordelen. Hier beschrijven we de gedetailleerde procedures voor de oprichting van een-EtOH-geïnduceerde fibrotische lever model en voor het uitvoeren van chemische schermen gebruik van dit model in de zebravis. Verder werden tijdsverloop analyses uitgevoerd om te onderzoeken hoe levercel regeneratie plaatsvindt in de fibrotische lever. Dit protocol zal een waardevol instrument om de mechanismen en strategieën van het verbeteren van levercel regeneratie in de fibrotische lever te bestuderen bieden.
Protocol
Representative Results
Discussion
We observed HPC gemedieerde hepatocyte regeneratie in EtOH / MTZ behandelde levers herstellen, wat suggereert dat zelfs in aanwezigheid van aanzienlijke hoeveelheid ECM eiwitten waaronder fibrillair type I collageen, het HPC's behouden hun vermogen tot regenereren zoals hepatocyten. Het enige MTZ-behandeling niet significant toenemen afzetting van ECM eiwitten, terwijl de EtOH enige behandeling niet HPC activering 15 hoefden te induceren. Door toepassing van de gecombineerde behandeling EtOH / MTZ, konden…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd mede ondersteund door subsidies van de GTEC (2731336 en 1411318), de NIH (K01DK081351), en de NSF (1.354.837) naar CHS Wij danken Alem Giorgis voor kritische lezing van het manuscript.
Materials
| Calcium sulfate hemihydrate (CaSO4) | Acros | AC385355000 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | EMD | MX0075 | |
| 1,4-Piperazinediethanesulfonic acid (PIPES) | Sigma-Aldrich | P6757 | |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | 200 proof |
| Formaldehyde | Fisher Scientific | F79-500 | |
| Metronidazole (MTZ) | Sigma-Aldrich | M3761 | |
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| 3-amino benzoic acid ethyl ester (Tricaine) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) tablet | Amresco | E404 | Dissolve one tablet with 100 ml distilled water |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| Bovine serum albumin | Fisher Scientific | BP1600 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151 | |
| Low-melting agarose | Amresco | BP165 | |
| Stem Cell Signaling Compound Library | Selleck Chemicals | L2100 | 10mM stock in DMSO |
| ActiProbe-1K Library | Timtec | ActiProbe-1K | 10mM stock in DMSO |
| SB 415286 | Selleck Chemicals | S2729 | Dissolve with DMSO to 10mM |
| CHIR-99021 | Selleck Chemicals | S2924 | Dissolve with DMSO to 10mM |
| Anti-Collagen I antibody | Abcam | ab23730 | Use at 1:100 for immunostaining, reacts with fish |
| AlexaFluor 647 Donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Molecular Probes | A31573 | Use at 1:200 for immunostaining |
| Mounting media (Vectorshield) | Vector Laboratories | H-1400 | |
| 100 mm petri dish | VWR | 25384-088 | |
| 24-well plate | VWR | 10062-896 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | Dumont #55 |
| Glass slide | VWR | 48312-003 | 75×25 mm |
| Cover glass | VWR | 48366-045 | 18 mm |
| Plastic wrap | Fisher Scientific | 22305654 | |
| Aluminum foil | Fisher Scientific | 1213100 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | |
| Vibrotome | Leica | VT1000 S | |
| Stereo microscope | Leica | M80 | |
| Epifluoresent microscope | Leica | M205 FA | |
| Confocol microscope | Zeiss | LSM700 |
Riferimenti
- Michalopoulos, G. K. Liver regeneration. J Cell Physiol. 213 (2), 286-300 (2007).
- Duncan, A. W., Dorrell, C., Grompe, M. Stem cells and liver regeneration. Gastroenterology. 137 (2), 466-481 (2009).
- Shepard, C. W., Finelli, L., Alter, M. J. Global epidemiology of hepatitis C virus infection. Lancet Infect Dis. 5 (9), 558-567 (2005).
- Hernandez-Gea, V., Friedman, S. L. Pathogenesis of liver fibrosis. Annu Rev Pathol. 6, 425-456 (2011).
- Bataller, R., Brenner, D. A. Liver fibrosis. J Clin Invest. 115 (2), 209-218 (2005).
- Kisseleva, T., Brenner, D. A. Anti-fibrogenic strategies and the regression of fibrosis. Best Pract Res Clin Gastroenterol. 25 (2), 305-317 (2011).
- Constandinou, C., Henderson, N., Iredale, J. P. Modeling liver fibrosis in rodents. Methods Mol Med. 117, 237-250 (2005).
- Gabele, E., et al. A new model of interactive effects of alcohol and high-fat diet on hepatic fibrosis. Alcohol Clin Exp Res. 35 (7), 1361-1367 (2011).
- Lieber, C. S. Alcoholic fatty liver: its pathogenesis and mechanism of progression to inflammation and fibrosis. Alcohol. 34 (1), 9-19 (2004).
- Poss, K. D. Advances in understanding tissue regenerative capacity and mechanisms in animals. Nat Rev Genet. 11 (10), 710-722 (2010).
- Jang, Z. H., et al. Metabolic profiling of an alcoholic fatty liver in zebrafish (Danio rerio). Mol Biosyst. 8 (7), 2001-2009 (2012).
- Passeri, M. J., Cinaroglu, A., Gao, C., Sadler, K. C. Hepatic steatosis in response to acute alcohol exposure in zebrafish requires sterol regulatory element binding protein activation. Hepatology. 49 (2), 443-452 (2009).
- Yin, C., Evason, K. J., Maher, J. J., Stainier, D. Y. The basic helix-loop-helix transcription factor, heart and neural crest derivatives expressed transcript 2, marks hepatic stellate cells in zebrafish: analysis of stellate cell entry into the developing liver. Hepatology. 56 (5), 1958-1970 (2012).
- Lin, J. N., et al. Development of an animal model for alcoholic liver disease in zebrafish. Zebrafish. 12 (4), 271-280 (2015).
- Huang, M., et al. Antagonistic interaction between Wnt and Notch activity modulates the regenerative capacity of a zebrafish fibrotic liver model. Hepatology. 60 (5), 1753-1766 (2014).
- Curado, S., Stainier, D. Y., Anderson, R. M. Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies. Nat Protoc. 3 (6), 948-954 (2008).
- Parsons, M. J., et al. Notch-responsive cells initiate the secondary transition in larval zebrafish pancreas. Mech Dev. 126 (10), 898-912 (2009).
- Baker, K., Warren, K. S., Yellen, G., Fishman, M. C. Defective ‘pacemaker’ current (Ih) in a zebrafish mutant with a slow heart rate. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (9), 4554-4559 (1997).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. J Vis Exp. (69), e4196 (2012).
- Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of organs from the adult zebrafish. J Vis Exp. (37), (2010).
- Paku, S., Schnur, J., Nagy, P., Thorgeirsson, S. S. Origin and structural evolution of the early proliferating oval cells in rat liver. Am J Pathol. 158 (4), 1313-1323 (2001).
- Turner, R., et al. Human hepatic stem cell and maturational liver lineage biology. Hepatology. 53 (3), 1035-1045 (2011).
- Kodama, Y., Hijikata, M., Kageyama, R., Shimotohno, K., Chiba, T. The role of notch signaling in the development of intrahepatic bile ducts. Gastroenterology. 127 (6), 1775-1786 (2004).
- Ryback, R., Percarpio, B., Vitale, J. Equilibration and metabolism of ethanol in the goldfish. Nature. 222 (5198), 1068-1070 (1969).
- Mathias, J. R., Saxena, M. T., Mumm, J. S. Advances in zebrafish chemical screening technologies. Future Med Chem. 4 (14), 1811-1822 (2012).
- Chen, C. H., Durand, E., Wang, J., Zon, L. I., Poss, K. D. zebraflash transgenic lines for in vivo bioluminescence imaging of stem cells and regeneration in adult zebrafish. Development. 140 (24), 4988-4997 (2013).
- Westhoff, J. H., et al. Development of an automated imaging pipeline for the analysis of the zebrafish larval kidney. PLoS One. 8 (12), e82137 (2013).
- Perlman, Z. E., et al. Multidimensional drug profiling by automated microscopy. Science. 306 (5699), 1194-1198 (2004).
- Chu, J., Sadler, K. C. New school in liver development: lessons from zebrafish. Hepatology. 50 (5), 1656-1663 (2009).
- Choi, T. Y., Ninov, N., Stainier, D. Y., Shin, D. Extensive conversion of hepatic biliary epithelial cells to hepatocytes after near total loss of hepatocytes in zebrafish. Gastroenterology. 146 (3), 776-788 (2014).
- He, J., Lu, H., Zou, Q., Luo, L. Regeneration of liver after extreme hepatocyte loss occurs mainly via biliary transdifferentiation in zebrafish. Gastroenterology. 146 (3), 789-800 (2014).
- Yao, Y., et al. Fine structure, enzyme histochemistry, and immunohistochemistry of liver in zebrafish. Anat Rec (Hoboken). 295 (4), 567-576 (2012).
- Yovchev, M. I., Xue, Y., Shafritz, D. A., Locker, J., Oertel, M. Repopulation of the fibrotic/cirrhotic rat liver by transplanted hepatic stem/progenitor cells and mature hepatocytes. Hepatology. 59 (1), 284-295 (2014).
