Isolatie, Cultuur en Transductie van Adult Mouse Cardiomyocytes
Summary
This protocol describes a step-by-step method for the reproducible isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes with high yield, purity, and viability.
Abstract
Gekweekte hartspiercellen kunnen worden gebruikt om cardiomyocyt biologische technieken gebruiken die complementair is aan in vivo systemen te bestuderen. Bijvoorbeeld, de zuiverheid en de bereikbaarheid van in vitro kweek maakt fijne controle over biochemische analyses, live beeldvorming en elektrofysiologie. Langetermijnkweek cardiomyocyten biedt toegang tot aanvullende experimentele benaderingen die niet op korte termijn kweken kan worden voltooid. Bijvoorbeeld de in vitro onderzoek dedifferentiatie, celcyclus herintreding en celdeling tot nu toe grotendeels beperkt tot cardiomyocyten van de rat, die voorkomen robuuster langetermijnkweek zijn. Echter, de beschikbaarheid van een rijke toolset van transgene muizen lijnen en goed ontwikkelde ziekte modellen muis systemen aantrekkelijk voor cardiale onderzoek. Hoewel verschillende rapporten bestaan van volwassen muis cardiomyocyt isolatie, enkele studies tonen aan hun lange termijn cultuur. Hier voorgesteld, is een stap-voor-stap werkwijze voor deisolatie en de lange termijn de cultuur van volwassen muis hartspiercellen. Eerst wordt retrograde Langendorff perfusie gebruikt om efficiënt verteren het hart met proteasen, gevolgd door zwaartekracht sedimentatie zuivering. Na een periode van dedifferentiatie na isolering, de cellen geleidelijk hechten aan de kweek en kan gekweekt weken. Adenovirus cellysaat wordt gebruikt om de geïsoleerde cardiomyocyten efficiënt transduceren. Deze methoden bieden een eenvoudige, maar krachtige modelsysteem om cardiale biologie studeren.
Introduction
Gekweekte hartspiercellen worden vaak gebruikt om cel gedrag te observeren in een goed gecontroleerde omgeving in vitro. Zo kunnen morfologische, elektrische, biochemische of mechanische celeigenschappen worden bestudeerd speciale substraten, 1,2 in gedefinieerde media, en in reactie op kleine moleculen, peptiden, genregulatie, 3 of elektrische stimulering. 4 De cellulaire inhoud eveneens met gedefinieerd co-culturen. 5 De in vitro experimenten zijn bruikbaar bij grote drugs of genetische screens en complement in vivo werkwijzen van verschillende soorten onderzoeken waarbij cardiomyocyt biologie.
Langlopende cultuur maakt experimentele wegen die vereisen langere tijd aan fenotypische verandering te bewerkstelligen. Een actueel voorbeeld is dat van volwassen zoogdieren cardiomyocyt proliferatie, indien dedifferentiatie, celcyclus herintreding en celdeling kenmerkend bestudeerd via seVeral dagen tot weken. 6,7 Hier het uitgebreide cultuur tijd vergemakkelijkt genetische manipulatie, 7,8 functionele dedifferentiatie (bijv sarcomeer demontage) 9 en mogelijk transcriptie dedifferentiatie. 6 Latere celcyclus re-entry en celdeling vereist nog langere periodes cultuur om te observeren, vooral als er meerdere rondes van verdeeldheid zijn de experimentele doel. Het belang van de cardiomyocyt celcyclus staat centraal in verschillende recente belangrijke wetenschappelijke werken van hart regeneratie, waarbij de dedifferentiatie en proliferatie van reeds bestaande hartspiercellen verantwoordelijk voor hart regeneratie in zebravis en neonatale muizen aangetoond. 10-12 dus de mogelijkheid te stimuleren dedifferentiatie en celcyclus re-entry in zoogdiercellen volwassen hartspiercellen blijft een belangrijke vraag in het menselijke hart regeneratie 13-15
I n vitro experimenten bestuderen de celcyclus van zoogdiercellen cardiomyocyten hebben voornamelijk gebruikt rat bronnen, vanwege hun relatieve gemak van langetermijnkweek opzichte muismodellen. 16 echter murine systemen bieden een rijke bron van goed gekarakteriseerde transgene gereedschappen en ziektemodellen die bruikbaar zijn in zowel in vitro als in vivo protocollen. Zo heeft Cre-based lijn traceren de identificatie van reeds bestaande hartspiercellen ingesteld als bron regenereren myocardium in de neonatale muis hart in vivo. 12 In vitro onderzoek van lijn getraceerd neonatale muis hartspiercellen het onderzoek interacties met stromale heeft ingeschakeld cellen door co-kweek met fibroblasten. 5 vanwege zijn uitdagingen, 17 enkele gevallen bestaan uit de isolatie en langdurige kweek van volwassen muizen cardiomyocyten. 18,19
De isolatie van levensvatbare volwassen muizen cardiomyocyten korte termijn kweek alleen bekend is een uitdagende taak. dit protocol biedt stap-voor-stap instructies over hoe om levensvatbare hartspiercellen van volwassen muizen die gebruikt kan worden voor zowel de korte termijn als op lange termijn onderzoek te bereiken. Hartspiercellen die met dit protocol kan efficiënt worden getransduceerd met adénovirale vectoren 20,21 en gedurende weken. Deze werkwijzen verschaffen een krachtig systeem om cardiomyocyt studie biologie in vitro.
De hierin beschreven werkwijzen zijn gebaseerd op verschillende elementen uit vroegere werken varianten van het Langendorff retrograde perfusie. 18,22 Hoewel verschillende protocollen van de isolatie van volwassen muizen cardiomyocyten korte termijn cultuur en onderzoek 23-25 het voordeel gepubliceerd dit protocol is de mogelijkheid om de geïsoleerde cardiomyocyten kweek op lange termijn. Deze zijn nuttig voor het bestuderen van cellulaire processen waarbij ectopische genexpressie en vereisen langere tijdsperioden, bijvoorbeeld in cellulaire herprogrammering strategieën.
Protocol
Representative Results
Discussion
De algehele gezondheid van de geïsoleerde cardiomyocyten afhankelijk van verschillende belangrijke aspecten van dit protocol. Ten eerste, de tijd tussen hart extractie perfusie is kritisch en moet worden uitgevoerd in 5 minuten of minder. Verwijdering van calcium helpt bij cel-cel interacties dissociëren, maar een negatieve invloed celgezondheid lange termijn. 29-32 Zo vinden we het voldoende om calcium te verwijderen tijdens de eerste paar minuten perfusie met EGTA (ethyleenglycol-azijnzuur) chelatie, <sup…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit project werd gefinancierd door de UCSF Program for Breakthrough Biomedisch Onderzoek (deels gefinancierd door de Sandler Foundation), de NIH Pathway to Independence Award (R00HL114738), en de Edward Mallinckrodt Jr Foundation. JJ werd ondersteund door een postdoctorale beurs van de NIH (T32HL007731). De auteurs zijn zelf verantwoordelijk voor de inhoud van dit werk, dat niet noodzakelijk de officiële standpunten van de NIH vertegenwoordigt.
Materials
| Equipment | |||
| Heated water jacket | Radnoti | 158831 | |
| Circulating heated water bath, Isotemp | Fisher Scientific | 3013 | |
| Laboratory pump | Watson-Marlow | 323 | |
| Hemostats | Exelta | 63042-090 | |
| Tissue forceps | VWR | 470128034 | |
| Dumont #7 curved forceps | FST | 91197-00 | |
| Dumont #5 fine forceps | FST | 11251-20 | |
| Small dissection scissors | VWR | 470128034 | |
| Extra fine bonn scissors | FST | 14084-08 | |
| Fine spring scissors | FST | 91500-09 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| Na2HPO4-7H2O | Fisher | S25837 | |
| MgSO4-7H2O | Fisher | S25414 | |
| Taurine | Sigma | 86329 | |
| Butane dione monoxime (BDM) | Sigma | B0753 | |
| HEPES | Fisher | BP310100 | |
| Glucose | Sigma | G-7021 | |
| Insulin | Novo Nordisk | 393153 | |
| EGTA | Amresco | 0732-288 | |
| Protease, type XIV | Sigma | P5147 | |
| Collagenase II | Worthington | LS004176 | |
| MEM | Corning | 15-010-CV | |
| FBS, heat inactivated | JRS | 43613 | |
| Primocin | Invitrogen | NC9141851 | |
| Ethyl Carbamate | Alfa Aesar | AAA44804-18 | |
| 215 micron mesh | Component supply | U-CMN-215-A | |
| 20 G blunt ended needle | Becton Dickinson | 305183 | |
| 20 G beveled needle | Becton Dickinson | 305176 | |
| Lab tape | VWR | 89097-990 | |
| Surgical tape | 3M | 1527-0 | |
| Silk suture, 7-0 | Teleflex | 15B051000 | |
| Mouse anti-alpha-actinin antibody | Sigma | A7811 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1 antibody | Thermo Fisher | A21121 |
Riferimenti
- Patel, A. K., Celiz, A. D., et al. A defined synthetic substrate for serum free culture of human stem cell derived cardiomyocytes with improved functional maturity identified using combinatorial materials microarrays. Biomaterials. 61, 257-265 (2015).
- Mathur, A., Loskill, P., et al. Human iPSC-based Cardiac Microphysiological System For Drug Screening Applications. Sci Rep. 5, 8883 (2015).
- Mahmoud, A. I., Kocabas, F., et al. Meis1 regulates postnatal cardiomyocyte cell cycle arrest. Nature. 497 (7448), 249-253 (2013).
- Baumgartner, S., Halbach, M., et al. Electrophysiological and morphological maturation of murine fetal cardiomyocytes during electrical stimulation in vitro. J Cardiovasc Pharmacol Ther. 20 (1), 104-112 (2015).
- Ieda, M., Tsuchihashi, T., et al. Cardiac fibroblasts regulate myocardial proliferation through beta1 integrin signaling. Dev Cell. 16 (2), 233-244 (2009).
- Zhang, Y., Li, T. S., et al. Dedifferentiation and proliferation of mammalian cardiomyocytes. PLoS One. 5 (9), e12559 (2010).
- Engel, F. B., Schebesta, M., et al. p38 MAP kinase inhibition enables proliferation of adult mammalian cardiomyocytes. Gene Dev. 19 (10), 1175-1187 (2005).
- Sakurai, T., Lanahan, A., Woolls, M. J., Li, N., Tirziu, D., Murakami, M. Live cell imaging of primary rat neonatal cardiomyocytes following adenoviral and lentiviral transduction using confocal spinning disk microscopy. J Vis Exp. (88), e51666 (2014).
- Ahuja, P., Perriard, E., Perriard, J. C., Ehler, E. Sequential myofibrillar breakdown accompanies mitotic division of mammalian cardiomyocytes. J Cell Sci. 117 (Pt 15), 3295-3306 (2004).
- Kikuchi, K., Holdway, J. E., et al. Primary contribution to zebrafish heart regeneration by gata4(+) cardiomyocytes. Nature. 464 (7288), 601-605 (2010).
- Jopling, C., Sleep, E., Raya, M., Martì, M., Raya, A., Izpisúa Belmonte, J. C. Zebrafish heart regeneration occurs by cardiomyocyte dedifferentiation and proliferation. Nature. 464 (7288), 606-609 (2010).
- Porrello, E. R., Mahmoud, A. I., et al. Transient Regenerative Potential of the Neonatal Mouse Heart. Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).
- Heallen, T., Morikawa, Y., et al. Hippo signaling impedes adult heart regeneration. Development. 140 (23), 4683-4690 (2013).
- Lin, Z., Zhou, P., et al. Pi3kcb links Hippo-YAP and PI3K-AKT signaling pathways to promote cardiomyocyte proliferation and survival. Circ Res. 116 (1), 35-45 (2015).
- Zebrowski, D. C., Vergarajauregui, S., et al. Developmental alterations in centrosome integrity contribute to the post-mitotic state of mammalian cardiomyocytes. eLife. 4, e05563 (2015).
- Schluter, K. D., Piper, H. M. . Practical Methods in Cardiovascular Research. , (2005).
- Zhou, Y. Y., Wang, S. Q., et al. Culture and adenoviral infection of adult mouse cardiac myocytes: methods for cellular genetic physiology. Am J Physiol Heart Circ Phys. 279 (1), H429-H436 (2000).
- Kruppenbacher, J. P., May, T., Eggers, H. J., Piper, H. M. Cardiomyocytes of adult mice in long-term culture. Naturwissenschaften. 80 (3), 132-134 (1993).
- Fredj, S., Bescond, J., Louault, C., Potreau, D. Interactions between cardiac cells enhance cardiomyocyte hypertrophy and increase fibroblast proliferation. Journal of Cellular Physiology. 202 (3), 891-899 (2005).
- Li, Z., Sharma, R. V., Duan, D., Davisson, R. L. Adenovirus-mediated gene transfer to adult mouse cardiomyocytes is selectively influenced by culture medium. J Gene Med. 5 (9), 765-772 (2003).
- Luo, J., Deng, Z. L., et al. A protocol for rapid generation of recombinant adenoviruses using the AdEasy system. Nat Protoc. 2 (5), 1236-1247 (2007).
- Shioya, T. A simple technique for isolating healthy heart cells from mouse models. J Physiol Sci. 57 (6), 327-335 (2007).
- Li, D., Wu, J., Bai, Y., Zhao, X., Liu, L. Isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy. J Vis Exp. (87), e51357 (2014).
- Wolska, B. M., Solaro, R. J. Method for isolation of adult mouse cardiac myocytes for studies of contraction and microfluorimetry. Am J Physiol Heart Circ Phys. 271 (3), H1250-H1255 (1996).
- Pinz, I., Zhu, M., Mende, U., Ingwall, J. S. An improved isolation procedure for adult mouse cardiomyocytes. Cell Biochem Biophys. 61 (1), 93-101 (2011).
- Di Stefano, V., Giacca, M., Capogrossi, M. C., Crescenzi, M., Martelli, F. Knockdown of cyclin-dependent kinase inhibitors induces cardiomyocyte re-entry in the cell cycle. J Biol Chem. 286 (10), 8644-8654 (2011).
- Malouf, N. N., McMahon, D., Oakeley, A. E., Anderson, P. A. A cardiac troponin T epitope conserved across phyla. J Biol Chem. 267 (13), 9269-9274 (1992).
- Ehler, E., Moore-Morris, T., Lange, S. Isolation and culture of neonatal mouse cardiomyocytes. J Vis Exp. (79), e50154 (2013).
- Daly, M. J., Elz, J. S., Nayler, W. G. Contracture and the calcium paradox in the rat heart. Circ Res. 61 (4), 560-569 (1987).
- Piper, H. Culturing of calcium stable adult cardiac myocytes. J Mol Cell Cardiol. 14 (7), 397-412 (1982).
- Ashraf, M. Correlative studies on sarcolemmal ultrastructure, permeability, and loss of intracellular enzymes in the isolated heart perfused with calcium-free medium. Am J Pathol. 97 (2), 411-432 (1979).
- Piper, H. The calcium paradox revisited An artefact of great heuristic value. Cardiovasc Res. 45 (1), 123-127 (2000).
- Higuchi, H., Takemori, S. Butanedione monoxime suppresses contraction and ATPase activity of rabbit skeletal muscle. J Biochem. 105 (4), 638-643 (1989).
- Rother, J., Richter, C., et al. Crosstalk of cardiomyocytes and fibroblasts in co-cultures. Open biology. 5 (6), 150038 (2015).
- Fujio, Y., Nguyen, T., Wencker, D., Kitsis, R. N., Walsh, K. Akt Promotes Survival of Cardiomyocytes In Vitro and Protects Against Ischemia-Reperfusion Injury in Mouse Heart. Circulation. 101 (6), 660-667 (2000).
- Dambrot, C., Braam, S. R., Tertoolen, L. G. J., Birket, M., Atsma, D. E., Mummery, C. L. Serum supplemented culture medium masks hypertrophic phenotypes in human pluripotent stem cell derived cardiomyocytes. Journal of cellular and molecular medicine. 18 (8), 1509-1518 (2014).
- Karliner, J. S., Simpson, P. C., Taylor, J. E., Honbo, N., Woloszyn, W. Adrenergic receptor characteristics of cardiac myocytes cultured in serum-free medium: Comparison with serum-supplemented medium. Biochemical and Biophysical Research Communications. 128 (1), 376-382 (1985).
- Zheng, X., Baker, H., Hancock, W. S., Fawaz, F., McCaman, M., Pungor, E. Proteomic analysis for the assessment of different lots of fetal bovine serum as a raw material for cell culture. Part IV. Application of proteomics to the manufacture of biological drugs. Biotechnology progress. 22 (5), 1294-1300 (2006).
- Soonpaa, M. H., Kim, K. K., Pajak, L., Franklin, M., Field, L. J. Cardiomyocyte DNA synthesis and binucleation during murine development. Am J Physiol. 271 (5 Pt 2), H2183-H2189 (1996).
- Engel, F. B., Hsieh, P. C. H., Lee, R. T., Keating, M. T. FGF1/p38 MAP kinase inhibitor therapy induces cardiomyocyte mitosis, reduces scarring, and rescues function after myocardial infarction. P Natl Acad Sci USA. 103 (42), 15546-15551 (2006).
- Tian, Y., Liu, Y., et al. A microRNA-Hippo pathway that promotes cardiomyocyte proliferation and cardiac regeneration in mice. Sci Transl Med. 7 (279), 279ra38 (2015).
- Soonpaa, M. H., Koh, G. Y., et al. Cyclin D1 overexpression promotes cardiomyocyte DNA synthesis and multinucleation in transgenic mice. J Clin Invest. 99 (11), 2644-2654 (1997).
- Stewart, S., Stankunas, K. Limited dedifferentiation provides replacement tissue during zebrafish fin regeneration. Dev Biol. 365 (2), 339-349 (2012).
- Wu, C. H., Huang, T. Y., Chen, B. S., Chiou, L. L., Lee, H. S. Long-Duration Muscle Dedifferentiation during Limb Regeneration in Axolotls. PLoS One. 10 (2), e0116068 (2015).
- Nag, A. C., Lee, M. L., Kosiur, J. R. Adult cardiac muscle cells in long-term serum-free culture: myofibrillar organization and expression of myosin heavy chain isoforms. In vitro cellular & developmental biology journal of the Tissue Culture Association. 26 (5), 464-470 (1990).
- Lian, X., Hsiao, C., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. P Natl Acad Sci USA. 109 (27), E1848-E1857 (2012).
- Sohal, D. S., Nghiem, M., et al. Temporally Regulated and Tissue-Specific Gene Manipulations in the Adult and Embryonic Heart Using a Tamoxifen-Inducible Cre Protein. Circ Res. 89 (1), 20-25 (2001).
- Hsieh, P. C. H., Segers, V. F. M., et al. Evidence from a genetic fate-mapping study that stem cells refresh adult mammalian cardiomyocytes after injury. Nat Med. 13 (8), 970-974 (2007).
