अलगाव, संस्कृति और वयस्क माउस cardiomyocytes के पारगमन
Summary
This protocol describes a step-by-step method for the reproducible isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes with high yield, purity, and viability.
Abstract
संवर्धित cardiomyocytes तकनीक है कि इन विवो प्रणालियों के पूरक हैं का उपयोग कर cardiomyocyte जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, पवित्रता और इन विट्रो संस्कृति की पहुंच जैव रासायनिक विश्लेषण, लाइव इमेजिंग, और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी पर ठीक नियंत्रण सक्षम बनाता है। cardiomyocytes के लंबे समय तक संस्कृति अतिरिक्त प्रयोगात्मक दृष्टिकोण है कि अल्पावधि संस्कृतियों में पूरा नहीं किया जा सकता है प्रदान करता है। उदाहरण के लिए, dedifferentiation, कोशिका चक्र पुनः प्रवेश, और कोशिका विभाजन की इन विट्रो जांच इस प्रकार अब तक काफी हद तक चूहे cardiomyocytes है, जो लंबे समय तक संस्कृति में अधिक मजबूत होना प्रकट करने के लिए प्रतिबंधित कर दिया गया है। हालांकि, ट्रांसजेनिक माउस लाइनों और अच्छी तरह से विकसित रोग मॉडल की एक समृद्ध toolset की उपलब्धता माउस सिस्टम हृदय अनुसंधान के लिए आकर्षक बनाते हैं। हालांकि कई रिपोर्टों वयस्क माउस cardiomyocyte अलगाव के मौजूद हैं, कुछ अध्ययनों से उनके दीर्घकालिक संस्कृति प्रदर्शित करता है। यहाँ प्रस्तुत करने के लिए एक कदम-दर-कदम विधि हैवयस्क माउस cardiomyocytes के अलगाव और लंबी अवधि संस्कृति। सबसे पहले, प्रतिगामी Langendorff छिड़काव कुशलता proteases के साथ दिल, गुरुत्वाकर्षण अवसादन शुद्धि के बाद पचाने के लिए प्रयोग किया जाता है। dedifferentiation निम्नलिखित अलगाव की अवधि के बाद, कोशिकाओं को धीरे-धीरे संस्कृति को देते हैं और सप्ताह के लिए संवर्धित किया जा सकता है। Adenovirus सेल lysate कुशलता से अलग cardiomyocytes transduce करने के लिए प्रयोग किया जाता है। इन विधियों हृदय जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए एक सरल, अभी तक शक्तिशाली मॉडल प्रणाली प्रदान करते हैं।
Introduction
संवर्धित cardiomyocytes अक्सर इन विट्रो में एक अच्छी तरह से नियंत्रित वातावरण में सेल व्यवहार पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया जाता है। उदाहरण के लिए, रूपात्मक बिजली, जैव रासायनिक, यांत्रिक या सेल गुण इंजीनियर substrates पर अध्ययन किया जा सकता है, परिभाषित मीडिया में 1,2, और छोटे अणु दवाओं, पेप्टाइड्स, जीन विनियमन, 3 या बिजली की उत्तेजना के जवाब में। 4 सेलुलर सामग्री सकते हैं यह भी परिभाषित सह संस्कृतियों का उपयोग कर नियंत्रित किया जाए। 5 ये इन विट्रो प्रयोगों बड़ी दवा या आनुवंशिक स्क्रीन में उपयोगी होते हैं और cardiomyocyte जीव विज्ञान से जुड़े जांच के विभिन्न प्रकारों के लिए विवो तरीकों में पूरक हैं।
लंबे समय तक संस्कृति प्रयोगात्मक रास्ते है कि बढ़ाया समय की अवधि की आवश्यकता होती है प्ररूपी परिवर्तन को प्राप्त करने के लिए सक्षम बनाता है। एक समय पर उदाहरण वयस्क स्तनधारी cardiomyocyte प्रसार, जहां dedifferentiation, कोशिका चक्र पुनः प्रवेश, और कोशिका विभाजन आम तौर पर खत्म अध्ययन किया है एसई का हैसप्ताह के दिनों veral। 6,7 इधर, बढ़ाया संस्कृति समय आनुवंशिक हेरफेर, 7,8 कार्यात्मक dedifferentiation (जैसे, sarcomeric disassembly) 9 और संभावित ट्रांसक्रिप्शनल dedifferentiation की सुविधा। 6 इसके बाद सेल चक्र पुनः प्रवेश और कोशिका विभाजन भी अब संस्कृति अवधि की आवश्यकता है निरीक्षण करने के लिए, खासकर अगर विभाजन के कई दौर प्रयोगात्मक लक्ष्य कर रहे हैं। Cardiomyocyte सेल चक्र के महत्व को इस प्रकार हृदय उत्थान, जहां dedifferentiation और पूर्व मौजूदा cardiomyocytes के प्रसार zebrafish और नवजात चूहों में दिल के उत्थान के लिए जिम्मेदार दिखाया गया है में हाल ही में कई प्रमुख वैज्ञानिक कार्यों के लिए केंद्रीय है। 10-12, संभावना स्तनधारी वयस्क cardiomyocytes में dedifferentiation और सेल चक्र पुनः प्रवेश प्रोत्साहित करने के लिए मानव हृदय उत्थान 13-15 में एक महत्वपूर्ण सवाल बना हुआ है
मैं n विट्रो प्रयोगों स्तनधारी हृदय के सेल चक्र का अध्ययनmyocytes मुख्य रूप से माउस मॉडल की तुलना में लंबे समय तक संस्कृति की उनके रिश्तेदार आसानी के कारण चूहे स्रोतों का इस्तेमाल किया है। 16 हालांकि, murine सिस्टम अच्छी तरह से विशेषता ट्रांसजेनिक उपकरण और रोग मॉडल है कि दोनों में इन विट्रो और इन विवो में उपयोगी होते हैं के एक अमीर संसाधन की पेशकश प्रोटोकॉल। उदाहरण के लिए, Cre पर आधारित वंश अनुरेखण विवो में नवजात माउस दिल में मायोकार्डियम regenerating के एक स्रोत के रूप में पूर्व मौजूदा cardiomyocytes की पहचान के लिए सक्षम है। 12 में इन विट्रो वंश का पता लगाया नवजात माउस cardiomyocytes की पढ़ाई stromal के साथ बातचीत की परीक्षा के लिए सक्षम है fibroblasts के साथ सह संस्कृति के माध्यम से कोशिकाओं। 5 हालांकि, इसकी चुनौतियों की वजह से, कुछ रिपोर्टों 17 वयस्क माउस cardiomyocytes के अलगाव और लंबी अवधि संस्कृति के लिए मौजूद हैं। 18,19
अकेले अल्पकालिक संस्कृति के लिए व्यवहार्य वयस्क माउस cardiomyocytes के अलगाव एक चुनौती भरा काम हो जाता है। इस protocराजभाषा कैसे वयस्क चूहों कि दोनों अल्पकालिक के साथ ही लंबी अवधि की जांच के लिए इस्तेमाल किया जा सकता से व्यवहार्य cardiomyocytes प्राप्त करने के लिए पर कदम दर कदम निर्देश प्रदान करता है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर अलग cardiomyocytes कुशलता adenoviral वैक्टर 20,21 और हफ्तों के लिए सुसंस्कृत साथ ट्रांसड्यूस जा सकता है। इन तरीकों में इन विट्रो में cardiomyocyte जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली प्रणाली प्रदान करते हैं।
इस के साथ साथ वर्णित विधि पिछले कार्यों Langendorff प्रतिगामी छिड़काव के रूपांतरों का उपयोग करने से कई तत्वों पर आधारित हैं। 18,22 हालांकि कई प्रोटोकॉल अल्पकालिक संस्कृति और अध्ययन, 23-25 के लाभ के लिए वयस्क माउस cardiomyocytes के अलगाव पर प्रकाशित किया गया है इस प्रोटोकॉल संस्कृति करने की क्षमता अलग cardiomyocytes लंबी अवधि है। इस सेलुलर अस्थानिक जीन अभिव्यक्ति से जुड़े और इस तरह सेलुलर reprogramming रणनीतियों में के रूप में समय की विस्तारित अवधि के, की आवश्यकता होती है प्रक्रियाओं के अध्ययन में उपयोगी हो जाएगा।
Protocol
Representative Results
Discussion
पृथक cardiomyocytes के समग्र स्वास्थ्य के इस प्रोटोकॉल के कई महत्वपूर्ण पहलुओं पर निर्भर करता है। सबसे पहले, छिड़काव करने के लिए दिल से निकासी के समय महत्वपूर्ण है और 5 मिनट या उससे कम समय में किया जाना चाहिए। कै?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस परियोजना के निर्णायक जैव चिकित्सा अनुसंधान के लिए UCSF कार्यक्रम (सैंडलर फाउंडेशन द्वारा वित्त पोषित में भाग), एनआईएच मार्ग स्वतंत्रता पुरस्कार के लिए (R00HL114738), और एडवर्ड Mallinckrodt जूनियर फाउंडेशन द्वारा वित्त पोषित किया गया। जे जे एनआईएच (T32HL007731) से एक postdoctoral फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया। लेखक इस काम है, जो जरूरी एनआईएच के आधिकारिक विचार का प्रतिनिधित्व नहीं करता की सामग्री के लिए पूरी तरह जिम्मेदार हैं।
Materials
| Equipment | |||
| Heated water jacket | Radnoti | 158831 | |
| Circulating heated water bath, Isotemp | Fisher Scientific | 3013 | |
| Laboratory pump | Watson-Marlow | 323 | |
| Hemostats | Exelta | 63042-090 | |
| Tissue forceps | VWR | 470128034 | |
| Dumont #7 curved forceps | FST | 91197-00 | |
| Dumont #5 fine forceps | FST | 11251-20 | |
| Small dissection scissors | VWR | 470128034 | |
| Extra fine bonn scissors | FST | 14084-08 | |
| Fine spring scissors | FST | 91500-09 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| Na2HPO4-7H2O | Fisher | S25837 | |
| MgSO4-7H2O | Fisher | S25414 | |
| Taurine | Sigma | 86329 | |
| Butane dione monoxime (BDM) | Sigma | B0753 | |
| HEPES | Fisher | BP310100 | |
| Glucose | Sigma | G-7021 | |
| Insulin | Novo Nordisk | 393153 | |
| EGTA | Amresco | 0732-288 | |
| Protease, type XIV | Sigma | P5147 | |
| Collagenase II | Worthington | LS004176 | |
| MEM | Corning | 15-010-CV | |
| FBS, heat inactivated | JRS | 43613 | |
| Primocin | Invitrogen | NC9141851 | |
| Ethyl Carbamate | Alfa Aesar | AAA44804-18 | |
| 215 micron mesh | Component supply | U-CMN-215-A | |
| 20 G blunt ended needle | Becton Dickinson | 305183 | |
| 20 G beveled needle | Becton Dickinson | 305176 | |
| Lab tape | VWR | 89097-990 | |
| Surgical tape | 3M | 1527-0 | |
| Silk suture, 7-0 | Teleflex | 15B051000 | |
| Mouse anti-alpha-actinin antibody | Sigma | A7811 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1 antibody | Thermo Fisher | A21121 |
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