Isolamento, cultura e trasduzione di topo adulto cardiomiociti
Summary
This protocol describes a step-by-step method for the reproducible isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes with high yield, purity, and viability.
Abstract
Cardiomiociti in coltura possono essere utilizzati per studiare la biologia dei cardiomiociti utilizzando tecniche che sono complementari ai sistemi in vivo. Ad esempio, la purezza e l'accessibilità della cultura in vitro consente un controllo preciso analisi biochimiche, immagini dal vivo, e elettrofisiologia. cultura a lungo termine di cardiomiociti offre l'accesso ad approcci sperimentali aggiuntivi che non possono essere completate in colture a breve termine. Ad esempio, l'indagine in vitro di dedifferentiation, ciclo cellulare di rientro, e la divisione cellulare è finora stato in gran parte limitato a cardiomiociti di ratto, che sembrano essere più robusto nella cultura a lungo termine. Tuttavia, la disponibilità di un ricco set di strumenti di linee di topi transgenici e modelli di malattia ben sviluppati rendere i sistemi di mouse attrattivo per la ricerca cardiaca. Anche se diversi rapporti esistano di topo adulto isolamento dei cardiomiociti, alcuni studi dimostrano la loro cultura a lungo termine. Presentato qui, è un metodo step-by-step per laisolamento e di lungo periodo della cultura di cardiomiociti di topo adulto. Innanzitutto, retrograda perfusione Langendorff è usato per digerire efficientemente il cuore con proteasi, seguita da purificazione gravità sedimentazione. Dopo un periodo di de-differenziazione seguito isolamento, le cellule gradualmente attribuiscono alla cultura e possono essere coltivate per settimane. Adenovirus lisato cellulare viene utilizzato per trasdurre efficientemente i cardiomiociti isolati. Questi metodi forniscono un semplice, ma potente sistema modello per studiare la biologia cardiaco.
Introduction
Cardiomiociti in coltura sono spesso utilizzati per monitorare il comportamento delle cellule in un ambiente ben controllato in vitro. Ad esempio, le proprietà delle cellule morfologiche, elettriche, biochimici, o meccanici possono essere studiati su substrati ingegnerizzati, 1,2 in mezzi definiti, e in risposta ai farmaci piccole molecole, peptidi, regolazione genica, 3 o stimolazione elettrica. 4 Il contenuto cellulare può anche essere controllato tramite definiti co-culture. 5 Questi esperimenti in vitro sono utili per grandi schermi di droga o genetiche e si completano a metodi in vivo per i vari tipi di indagini che coinvolgono la biologia dei cardiomiociti.
cultura a lungo termine consente viali sperimentali che richiedono estese periodi di tempo per realizzare il cambiamento fenotipico. Un esempio attuale è quello di adulto la proliferazione dei cardiomiociti dei mammiferi, in cui de-differenziazione, del ciclo cellulare di rientro, e la divisione cellulare è tipicamente studiati su ségiorni veral o settimane. 6,7 Qui, il tempo di cultura estesa facilita la manipolazione genetica, 7,8 de-differenziazione funzionale (ad esempio, lo smontaggio sarcomerica) 9 e de-differenziazione potenzialmente trascrizionale. 6 successiva del ciclo cellulare di rientro e la divisione cellulare richiede periodi di cultura ancora più lunghi per osservare, soprattutto se più cicli di divisione sono l'obiettivo sperimentale. L'importanza del ciclo cellulare cardiomiociti è centrale per molti chiave recenti lavori scientifici nella rigenerazione del cuore, dove è stato dimostrato responsabile per la rigenerazione cardiaca in zebrafish e topi neonatali il dedifferentiation e la proliferazione dei cardiomiociti preesistenti. 10-12 Così, la possibilità per stimolare dedifferentiation e del ciclo cellulare rientro in cardiomiociti adulti mammiferi rimane una questione chiave nella rigenerazione cuore umano 13-15
I n esperimenti in vitro che studiano il ciclo cellulare dei mammiferi cardiomiociti sono prevalentemente utilizzati fonti ratto, grazie alla loro relativa facilità di coltura a lungo termine rispetto ai modelli di topo. 16 Tuttavia, sistemi murini offrono una ricca fonte di strumenti transgenici ben caratterizzati e modelli di malattia che sono utili sia in vitro che in vivo protocolli. Ad esempio, lineage tracing Cre-based ha permesso l'identificazione di cardiomiociti preesistenti come fonte di rigenerare miocardio nel cuore neonatale topo in vivo. 12 Studi in vitro su cardiomiociti di topo neonatali lineage tracing hanno permesso l'esame delle interazioni con stromale cellule attraverso co-coltura con fibroblasti. 5 Tuttavia, a causa delle sue sfide, 17 pochi rapporti esistono di isolamento e di lungo periodo della cultura di cardiomiociti di topo adulto. 18,19
L'isolamento di vitali cardiomiociti di topo adulto per la cultura a breve termine da solo è conosciuto per essere un compito impegnativo. Questo ProtoColo fornisce istruzioni passo-passo su come raggiungere cardiomiociti vitali da topi adulti che possono essere utilizzati sia per il breve termine, così come le indagini a lungo termine. Cardiomiociti isolati utilizzando questo protocollo possono essere efficacemente trasdotte con vettori adenovirali 20,21 e coltivate per settimane. Questi metodi forniscono un potente sistema per studiare la biologia dei cardiomiociti in vitro.
I metodi descritti nel presente documento si basano su diversi elementi da opere precedenti utilizzando varianti della perfusione retrograda Langendorff. 18,22 Sebbene diversi protocolli sono stati pubblicati sulla isolamento di cardiomiociti di topo adulto per la cultura a breve termine e di studio, 23-25 il vantaggio di questo protocollo è la capacità di cultura isolate cardiomiociti a lungo termine. Questo sarà utile nello studio dei processi cellulari in cui l'espressione genica ectopica e richiedono lunghi periodi di tempo, come nelle strategie riprogrammazione cellulare.
Protocol
Representative Results
Discussion
La salute generale dei cardiomiociti isolati dipende da diversi aspetti importanti di questo protocollo. In primo luogo, il tempo dall'estrazione cuore a perfusione è critica e deve essere eseguita in 5 minuti o meno. La rimozione di calcio aiuta a dissociarsi interazioni cellula-cellula, ma può avere un impatto negativo sulla salute delle cellule a lungo termine. 29-32 Così, troviamo sufficiente per rimuovere il calcio durante i primi pochi minuti di perfusione di EGTA (acido tetraacetico glicole etil…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo progetto è stato finanziato dal Programma UCSF per Breakthrough Ricerca Biomedica (finanziato in parte dalla Fondazione Sandler), il NIH Pathway to Independence Award (R00HL114738), e la Fondazione Edward Mallinckrodt Jr.. JJ è stato sostenuto da una borsa di studio post-dottorato dal NIH (T32HL007731). Gli autori sono gli unici responsabili del contenuto di questo lavoro, che non necessariamente rappresentano le opinioni ufficiali del NIH.
Materials
| Equipment | |||
| Heated water jacket | Radnoti | 158831 | |
| Circulating heated water bath, Isotemp | Fisher Scientific | 3013 | |
| Laboratory pump | Watson-Marlow | 323 | |
| Hemostats | Exelta | 63042-090 | |
| Tissue forceps | VWR | 470128034 | |
| Dumont #7 curved forceps | FST | 91197-00 | |
| Dumont #5 fine forceps | FST | 11251-20 | |
| Small dissection scissors | VWR | 470128034 | |
| Extra fine bonn scissors | FST | 14084-08 | |
| Fine spring scissors | FST | 91500-09 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| Na2HPO4-7H2O | Fisher | S25837 | |
| MgSO4-7H2O | Fisher | S25414 | |
| Taurine | Sigma | 86329 | |
| Butane dione monoxime (BDM) | Sigma | B0753 | |
| HEPES | Fisher | BP310100 | |
| Glucose | Sigma | G-7021 | |
| Insulin | Novo Nordisk | 393153 | |
| EGTA | Amresco | 0732-288 | |
| Protease, type XIV | Sigma | P5147 | |
| Collagenase II | Worthington | LS004176 | |
| MEM | Corning | 15-010-CV | |
| FBS, heat inactivated | JRS | 43613 | |
| Primocin | Invitrogen | NC9141851 | |
| Ethyl Carbamate | Alfa Aesar | AAA44804-18 | |
| 215 micron mesh | Component supply | U-CMN-215-A | |
| 20 G blunt ended needle | Becton Dickinson | 305183 | |
| 20 G beveled needle | Becton Dickinson | 305176 | |
| Lab tape | VWR | 89097-990 | |
| Surgical tape | 3M | 1527-0 | |
| Silk suture, 7-0 | Teleflex | 15B051000 | |
| Mouse anti-alpha-actinin antibody | Sigma | A7811 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1 antibody | Thermo Fisher | A21121 |
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