Isolasjon, kultur og transduksjon av Adult Mouse cardiomyocytes
Summary
This protocol describes a step-by-step method for the reproducible isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes with high yield, purity, and viability.
Abstract
Dyrkede cardiomyocytes kan brukes til å studere kardiomyocytt biologi ved hjelp av teknikker som er komplementære til in vivo systemer. For eksempel, renhet og tilgjengelighet av in vitro kultur gir god kontroll over biokjemiske analyser, live bildebehandling og elektrofysiologi. Langsiktig kultur cardiomyocytes tilbyr tilgang til flere eksperimentelle tilnærminger som ikke kan gjennomføres på kort sikt kulturer. For eksempel in vitro undersøkelse av dedifferentiation, cellesyklus re-entry, og celledeling har så langt stort sett vært begrenset til rotte cardiomyocytes, som synes å være mer robust i langsiktig kultur. Men tilgjengeligheten av en rik verktøysett av transgene mus linjer og velutviklede sykdomsmodeller lage muse systemer attraktivt for hjerteforskning. Selv om flere rapporter finnes av voksen mus kardiomyocytt isolasjon, noen studier viser deres langsiktige kultur. Presenteres her, er en steg-for-trinn metode forisolasjon og langsiktig kultur for voksne mus cardiomyocytes. Først blir retrograd Langendorff-perfusjon brukes for effektivt å fordøye hjerte med proteaser, etterfulgt av gravitasjonssedimentering rensing. Etter en periode med dedifferentiation etter isolasjon, cellene gradvis legge til kultur og kan dyrkes i flere uker. Adenovirus cellelysat brukes for effektivt å omsette de isolerte kardiomyocytter. Disse metodene gir en enkel, men kraftig modellsystem for å studere hjerte biologi.
Introduction
Dyrkede cardiomyocytes blir ofte brukt for å overvåke celle oppførsel i en godt kontrollert miljø in vitro. For eksempel kan morfologiske, elektriske, biokjemiske eller mekaniske celle egenskaper studeres på konstruerte underlag, 1,2 i definerte medier, og som svar på bioteknologiske legemidler, peptider, genregulering, tre eller elektrisk stimulering. 4 Den cellulære innhold kan også styres ved hjelp av definerte ko-kulturer. 5 Disse in vitro forsøk er nyttige i store medikament eller genetiske skjermer og komplement in vivo metoder for forskjellige typer av undersøkelser som involverer kardiomyocytt biologi.
Langsiktig kultur gjør eksperimentelle veier som krever lengre tid for å oppnå fenotypisk endring. Et betimelig eksempel er at av voksne pattedyr kardiomyocytt spredning, hvor dedifferentiation, cellesyklus re-entry, og celledeling er vanligvis studert over segVeral dager til uker. 6,7 Her letter den utvidede kultur tid genetisk manipulasjon, 7,8 funksjonell dedifferentiation (f.eks sarcomeric demontering) 9 og potensielt transkripsjonen dedifferentiation. 6 Etterfølgende cellesyklus re-entry og celledeling krever enda lengre kultur perioder å observere, spesielt hvis flere runder med delingen er den eksperimentelle mål. Betydningen av cardiomyocyte celle-syklus er sentral i flere nyere viktige vitenskapelige arbeider i hjertet gjenfødelse, der dedifferentiation og spredning av eksisterende cardiomyocytes har vist ansvarlig for hjerte regenerering i sebrafisk og neonatale mus. 10-12 Dermed muligheten å stimulere dedifferentiation og cellesyklus re-entry i pattedyr voksne cardiomyocytes fortsatt et sentralt spørsmål i menneskets hjerte regenerering 13-15
I n vitro eksperimenter studerer cellesyklus hos pattedyr cardiomyocytter har hovedsakelig benyttet rotte kilder, på grunn av deres relativt enkle langvarig kultur i forhold til musemodeller. 16 Imidlertid, murine systemer gir en rik kilde av velkarakteriserte transgene verktøy og sykdomsmodeller som er nyttige i både in vitro og in vivo protokoller. For eksempel har Cre-baserte avstamning aktiveres sporing identifisering av eksisterende cardiomyocytes som en kilde til regenererende myokard i neonatal mus hjerte in vivo. 12 In vitro studier av avstamning-spores neonatale mus cardiomyocytes har aktivert undersøkelse av interaksjoner med stromal cellene gjennom ko-kultur med fibroblaster. 5 imidlertid, på grunn av dens utfordringer og 17 noen rapporter foreligger i isolasjon og langtidskultur av voksne mus kardiomyocytter. 18,19
Isolasjon av levedyktige voksen mus cardiomyocytes for kortsiktig kultur alene er kjent for å være en utfordrende oppgave. dette protocol gir steg-for-steg instruksjoner om hvordan man skal oppnå levedyktige cardiomyocytes fra voksne mus som kan brukes for både kortsiktige og langsiktige undersøkelser. Cardiomyocytes isolert ved hjelp av denne protokollen kan effektivt transduced med adenovirus vektorer 20,21 og dyrket i flere uker. Disse metodene gir et kraftig system for å studere kardiomyocytt biologi in vitro.
Metodene som er beskrevet her er basert på flere elementer fra tidligere arbeider bruker varianter av Langendorff retrograd perfusjon. 18,22 Selv om flere protokoller har blitt publisert på isolering av voksne mus cardiomyocytes for kortsiktig kultur og studere, 23-25 fordelen av denne protokollen er evnen til kultur den isolerte cardiomyocytes langsiktig. Dette vil være nyttig ved undersøkelsen av cellulære prosesser som involverer ektopisk genekspresjon og som krever lengre tidsrom, for eksempel i cellulære omprogrammering strategier.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den generelle helsen til de isolerte cardiomyocytes avhenger av flere viktige aspekter ved denne protokollen. For det første er den tiden fra hjertet til utvinning perfusjon kritisk og bør utføres i 5 minutter eller mindre. Fjerning av kalsium bidrar til å dissosiere celle-celleinteraksjoner, men kan ha en negativ innvirkning celle helse på lang sikt. 29-32 Således er det funnet tilstrekkelig til å fjerne kalsium i løpet av de første få minutter av perfusjon med EGTA (etylenglykol-tetraeddiksyre) ch…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette prosjektet ble finansiert av UCSF Program for Gjennombrudd Biomedical Research (finansiert delvis av Sandler Foundation), NIH Pathway to Independence Award (R00HL114738) og Edward Mallinckrodt Jr. Foundation. JJ ble støttet av en postdoktorstipend fra NIH (T32HL007731). Forfatterne er selv ansvarlig for innholdet i dette arbeidet, som ikke nødvendigvis representerer den offisielle visninger av NIH.
Materials
| Equipment | |||
| Heated water jacket | Radnoti | 158831 | |
| Circulating heated water bath, Isotemp | Fisher Scientific | 3013 | |
| Laboratory pump | Watson-Marlow | 323 | |
| Hemostats | Exelta | 63042-090 | |
| Tissue forceps | VWR | 470128034 | |
| Dumont #7 curved forceps | FST | 91197-00 | |
| Dumont #5 fine forceps | FST | 11251-20 | |
| Small dissection scissors | VWR | 470128034 | |
| Extra fine bonn scissors | FST | 14084-08 | |
| Fine spring scissors | FST | 91500-09 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| Na2HPO4-7H2O | Fisher | S25837 | |
| MgSO4-7H2O | Fisher | S25414 | |
| Taurine | Sigma | 86329 | |
| Butane dione monoxime (BDM) | Sigma | B0753 | |
| HEPES | Fisher | BP310100 | |
| Glucose | Sigma | G-7021 | |
| Insulin | Novo Nordisk | 393153 | |
| EGTA | Amresco | 0732-288 | |
| Protease, type XIV | Sigma | P5147 | |
| Collagenase II | Worthington | LS004176 | |
| MEM | Corning | 15-010-CV | |
| FBS, heat inactivated | JRS | 43613 | |
| Primocin | Invitrogen | NC9141851 | |
| Ethyl Carbamate | Alfa Aesar | AAA44804-18 | |
| 215 micron mesh | Component supply | U-CMN-215-A | |
| 20 G blunt ended needle | Becton Dickinson | 305183 | |
| 20 G beveled needle | Becton Dickinson | 305176 | |
| Lab tape | VWR | 89097-990 | |
| Surgical tape | 3M | 1527-0 | |
| Silk suture, 7-0 | Teleflex | 15B051000 | |
| Mouse anti-alpha-actinin antibody | Sigma | A7811 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1 antibody | Thermo Fisher | A21121 |
Riferimenti
- Patel, A. K., Celiz, A. D., et al. A defined synthetic substrate for serum free culture of human stem cell derived cardiomyocytes with improved functional maturity identified using combinatorial materials microarrays. Biomaterials. 61, 257-265 (2015).
- Mathur, A., Loskill, P., et al. Human iPSC-based Cardiac Microphysiological System For Drug Screening Applications. Sci Rep. 5, 8883 (2015).
- Mahmoud, A. I., Kocabas, F., et al. Meis1 regulates postnatal cardiomyocyte cell cycle arrest. Nature. 497 (7448), 249-253 (2013).
- Baumgartner, S., Halbach, M., et al. Electrophysiological and morphological maturation of murine fetal cardiomyocytes during electrical stimulation in vitro. J Cardiovasc Pharmacol Ther. 20 (1), 104-112 (2015).
- Ieda, M., Tsuchihashi, T., et al. Cardiac fibroblasts regulate myocardial proliferation through beta1 integrin signaling. Dev Cell. 16 (2), 233-244 (2009).
- Zhang, Y., Li, T. S., et al. Dedifferentiation and proliferation of mammalian cardiomyocytes. PLoS One. 5 (9), e12559 (2010).
- Engel, F. B., Schebesta, M., et al. p38 MAP kinase inhibition enables proliferation of adult mammalian cardiomyocytes. Gene Dev. 19 (10), 1175-1187 (2005).
- Sakurai, T., Lanahan, A., Woolls, M. J., Li, N., Tirziu, D., Murakami, M. Live cell imaging of primary rat neonatal cardiomyocytes following adenoviral and lentiviral transduction using confocal spinning disk microscopy. J Vis Exp. (88), e51666 (2014).
- Ahuja, P., Perriard, E., Perriard, J. C., Ehler, E. Sequential myofibrillar breakdown accompanies mitotic division of mammalian cardiomyocytes. J Cell Sci. 117 (Pt 15), 3295-3306 (2004).
- Kikuchi, K., Holdway, J. E., et al. Primary contribution to zebrafish heart regeneration by gata4(+) cardiomyocytes. Nature. 464 (7288), 601-605 (2010).
- Jopling, C., Sleep, E., Raya, M., Martì, M., Raya, A., Izpisúa Belmonte, J. C. Zebrafish heart regeneration occurs by cardiomyocyte dedifferentiation and proliferation. Nature. 464 (7288), 606-609 (2010).
- Porrello, E. R., Mahmoud, A. I., et al. Transient Regenerative Potential of the Neonatal Mouse Heart. Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).
- Heallen, T., Morikawa, Y., et al. Hippo signaling impedes adult heart regeneration. Development. 140 (23), 4683-4690 (2013).
- Lin, Z., Zhou, P., et al. Pi3kcb links Hippo-YAP and PI3K-AKT signaling pathways to promote cardiomyocyte proliferation and survival. Circ Res. 116 (1), 35-45 (2015).
- Zebrowski, D. C., Vergarajauregui, S., et al. Developmental alterations in centrosome integrity contribute to the post-mitotic state of mammalian cardiomyocytes. eLife. 4, e05563 (2015).
- Schluter, K. D., Piper, H. M. . Practical Methods in Cardiovascular Research. , (2005).
- Zhou, Y. Y., Wang, S. Q., et al. Culture and adenoviral infection of adult mouse cardiac myocytes: methods for cellular genetic physiology. Am J Physiol Heart Circ Phys. 279 (1), H429-H436 (2000).
- Kruppenbacher, J. P., May, T., Eggers, H. J., Piper, H. M. Cardiomyocytes of adult mice in long-term culture. Naturwissenschaften. 80 (3), 132-134 (1993).
- Fredj, S., Bescond, J., Louault, C., Potreau, D. Interactions between cardiac cells enhance cardiomyocyte hypertrophy and increase fibroblast proliferation. Journal of Cellular Physiology. 202 (3), 891-899 (2005).
- Li, Z., Sharma, R. V., Duan, D., Davisson, R. L. Adenovirus-mediated gene transfer to adult mouse cardiomyocytes is selectively influenced by culture medium. J Gene Med. 5 (9), 765-772 (2003).
- Luo, J., Deng, Z. L., et al. A protocol for rapid generation of recombinant adenoviruses using the AdEasy system. Nat Protoc. 2 (5), 1236-1247 (2007).
- Shioya, T. A simple technique for isolating healthy heart cells from mouse models. J Physiol Sci. 57 (6), 327-335 (2007).
- Li, D., Wu, J., Bai, Y., Zhao, X., Liu, L. Isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy. J Vis Exp. (87), e51357 (2014).
- Wolska, B. M., Solaro, R. J. Method for isolation of adult mouse cardiac myocytes for studies of contraction and microfluorimetry. Am J Physiol Heart Circ Phys. 271 (3), H1250-H1255 (1996).
- Pinz, I., Zhu, M., Mende, U., Ingwall, J. S. An improved isolation procedure for adult mouse cardiomyocytes. Cell Biochem Biophys. 61 (1), 93-101 (2011).
- Di Stefano, V., Giacca, M., Capogrossi, M. C., Crescenzi, M., Martelli, F. Knockdown of cyclin-dependent kinase inhibitors induces cardiomyocyte re-entry in the cell cycle. J Biol Chem. 286 (10), 8644-8654 (2011).
- Malouf, N. N., McMahon, D., Oakeley, A. E., Anderson, P. A. A cardiac troponin T epitope conserved across phyla. J Biol Chem. 267 (13), 9269-9274 (1992).
- Ehler, E., Moore-Morris, T., Lange, S. Isolation and culture of neonatal mouse cardiomyocytes. J Vis Exp. (79), e50154 (2013).
- Daly, M. J., Elz, J. S., Nayler, W. G. Contracture and the calcium paradox in the rat heart. Circ Res. 61 (4), 560-569 (1987).
- Piper, H. Culturing of calcium stable adult cardiac myocytes. J Mol Cell Cardiol. 14 (7), 397-412 (1982).
- Ashraf, M. Correlative studies on sarcolemmal ultrastructure, permeability, and loss of intracellular enzymes in the isolated heart perfused with calcium-free medium. Am J Pathol. 97 (2), 411-432 (1979).
- Piper, H. The calcium paradox revisited An artefact of great heuristic value. Cardiovasc Res. 45 (1), 123-127 (2000).
- Higuchi, H., Takemori, S. Butanedione monoxime suppresses contraction and ATPase activity of rabbit skeletal muscle. J Biochem. 105 (4), 638-643 (1989).
- Rother, J., Richter, C., et al. Crosstalk of cardiomyocytes and fibroblasts in co-cultures. Open biology. 5 (6), 150038 (2015).
- Fujio, Y., Nguyen, T., Wencker, D., Kitsis, R. N., Walsh, K. Akt Promotes Survival of Cardiomyocytes In Vitro and Protects Against Ischemia-Reperfusion Injury in Mouse Heart. Circulation. 101 (6), 660-667 (2000).
- Dambrot, C., Braam, S. R., Tertoolen, L. G. J., Birket, M., Atsma, D. E., Mummery, C. L. Serum supplemented culture medium masks hypertrophic phenotypes in human pluripotent stem cell derived cardiomyocytes. Journal of cellular and molecular medicine. 18 (8), 1509-1518 (2014).
- Karliner, J. S., Simpson, P. C., Taylor, J. E., Honbo, N., Woloszyn, W. Adrenergic receptor characteristics of cardiac myocytes cultured in serum-free medium: Comparison with serum-supplemented medium. Biochemical and Biophysical Research Communications. 128 (1), 376-382 (1985).
- Zheng, X., Baker, H., Hancock, W. S., Fawaz, F., McCaman, M., Pungor, E. Proteomic analysis for the assessment of different lots of fetal bovine serum as a raw material for cell culture. Part IV. Application of proteomics to the manufacture of biological drugs. Biotechnology progress. 22 (5), 1294-1300 (2006).
- Soonpaa, M. H., Kim, K. K., Pajak, L., Franklin, M., Field, L. J. Cardiomyocyte DNA synthesis and binucleation during murine development. Am J Physiol. 271 (5 Pt 2), H2183-H2189 (1996).
- Engel, F. B., Hsieh, P. C. H., Lee, R. T., Keating, M. T. FGF1/p38 MAP kinase inhibitor therapy induces cardiomyocyte mitosis, reduces scarring, and rescues function after myocardial infarction. P Natl Acad Sci USA. 103 (42), 15546-15551 (2006).
- Tian, Y., Liu, Y., et al. A microRNA-Hippo pathway that promotes cardiomyocyte proliferation and cardiac regeneration in mice. Sci Transl Med. 7 (279), 279ra38 (2015).
- Soonpaa, M. H., Koh, G. Y., et al. Cyclin D1 overexpression promotes cardiomyocyte DNA synthesis and multinucleation in transgenic mice. J Clin Invest. 99 (11), 2644-2654 (1997).
- Stewart, S., Stankunas, K. Limited dedifferentiation provides replacement tissue during zebrafish fin regeneration. Dev Biol. 365 (2), 339-349 (2012).
- Wu, C. H., Huang, T. Y., Chen, B. S., Chiou, L. L., Lee, H. S. Long-Duration Muscle Dedifferentiation during Limb Regeneration in Axolotls. PLoS One. 10 (2), e0116068 (2015).
- Nag, A. C., Lee, M. L., Kosiur, J. R. Adult cardiac muscle cells in long-term serum-free culture: myofibrillar organization and expression of myosin heavy chain isoforms. In vitro cellular & developmental biology journal of the Tissue Culture Association. 26 (5), 464-470 (1990).
- Lian, X., Hsiao, C., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. P Natl Acad Sci USA. 109 (27), E1848-E1857 (2012).
- Sohal, D. S., Nghiem, M., et al. Temporally Regulated and Tissue-Specific Gene Manipulations in the Adult and Embryonic Heart Using a Tamoxifen-Inducible Cre Protein. Circ Res. 89 (1), 20-25 (2001).
- Hsieh, P. C. H., Segers, V. F. M., et al. Evidence from a genetic fate-mapping study that stem cells refresh adult mammalian cardiomyocytes after injury. Nat Med. 13 (8), 970-974 (2007).
