Isolamento, cultura e Transdução de rato adulto Cardiomyocytes
Summary
This protocol describes a step-by-step method for the reproducible isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes with high yield, purity, and viability.
Abstract
Cardiomiócitos cultivados podem ser usadas para estudar a biologia dos cardiomiócitos utilizando técnicas que são complementares a sistemas in vivo. Por exemplo, a pureza ea acessibilidade da cultura in vitro permite um controle fino sobre análises bioquímicas, imagens ao vivo e eletrofisiologia. cultura a longo prazo dos cardiomiócitos oferece acesso a abordagens experimentais adicionais que não podem ser concluídos em culturas de curto prazo. Por exemplo, a investigação in vitro de desdiferenciação, do ciclo celular de re-entrada e divisão de células tem, até agora, em grande parte sido restrita a cardiomiócitos de rato, que parecem ser mais robusta em cultura a longo prazo. No entanto, a disponibilidade de um rico conjunto de ferramentas de linhagens de camundongos transgênicos e modelos de doenças bem desenvolvidos tornar os sistemas de rato atraente para a investigação cardíaca. Embora existam vários relatos de rato adulto isolamento dos cardiomiócitos, alguns estudos demonstram sua cultura a longo prazo. Apresentado aqui, é um método passo-a-passo para oisolamento e longo prazo cultura de cardiomiócitos adultos do mouse. Em primeiro lugar, a perfusão de Langendorff retrógrada é usado eficientemente para digerir o coração com proteases, seguido por purificação por gravidade sedimentação. Após um período de desdiferenciação após o isolamento, as células gradualmente anexar à cultura e podem ser cultivadas por semana. ligado celular de adenovírus é utilizado para transduzir eficientemente os cardiomiócitos isolados. Esses métodos fornecem um simples sistema de modelo, mas poderosa para estudar a biologia cardíaca.
Introduction
Cardiomiócitos cultivados são frequentemente usados para monitorar o comportamento das células em um ambiente bem controlado in vitro. Por exemplo, as propriedades morfológicas celulares, eléctricos, bioquímicos, ou mecânicas pode ser estudada em substratos modificados, 1,2 em meio definido, e em resposta a fármacos de moléculas pequenas, péptidos, de regulação génica, 3 ou estimulação eléctrica. 4 O conteúdo celular pode também ser controlado usando co-culturas definidas. 5 Estas experiências in vitro são úteis em grande droga ou telas genéticos e complementar métodos in vivo para vários tipos de investigações envolvendo a biologia dos cardiomiócitos.
cultura de longo prazo permite avenidas experimentais que requerem períodos de tempo prolongados para alcançar a mudança fenotípica. Um exemplo oportuno é o da proliferação de cardiomiócitos de mamíferos adultos, onde desdiferenciação, ciclo celular re-entrada, e a divisão celular é normalmente estudado ao longo SEdias veral a semanas. 6,7 Aqui, o tempo de cultura estendido facilita a manipulação genética, 7,8 desdiferenciação funcional (por exemplo, a desmontagem sarcomérica) 9 e desdiferenciação potencialmente transcrição. 6 subsequente ciclo celular re-entrada e de divisão celular requer períodos de cultura ainda mais longos para observar, especialmente se vários ciclos de divisão são o objetivo experimental. A importância do ciclo celular cardiomiócitos é central para diversos trabalhos científicos recentes chave na regeneração do coração, onde o desdiferenciação e proliferação de cardiomiócitos pré-existentes tem sido mostrado responsável para a regeneração cardíaca no peixe-zebra e ratinhos neonatais. 10-12 Assim, a possibilidade para estimular a desdiferenciação do ciclo celular e re-entrada no cardiomiócitos adultos mamíferos continua a ser uma questão-chave na regeneração coração humano 13-15
Experimentos in vitro estudando o ciclo celular de cardio mamíferos I nmiócitos foram predominantemente utilizadas fontes de rato, devido à sua relativa facilidade de cultura a longo prazo em comparação com os modelos de ratinho. 16 No entanto, os sistemas de murideo oferecer uma rica fonte de ferramentas transgénicos bem caracterizados e modelos de doenças que são úteis em estudos in vitro e in vivo protocolos. Por exemplo, o rastreamento de linhagem baseada em Cre permitiu a identificação de cardiomiócitos pré-existentes como fonte de regeneração do miocárdio no coração neonatal do rato in vivo. 12 estudos in vitro de cardiomiócitos de rato neonatal traçado da linhagem permitiram a análise de interações com estromal células através de co-cultura com fibroblastos. 5 no entanto, devido aos seus desafios, 17 existem poucos relatos de cultura e isolamento de longo prazo de cardiomiócitos de rato adulto 18,19.
O isolamento dos cardiomiócitos viáveis de ratinho adulto para a cultura a curto prazo só é conhecido por ser uma tarefa difícil. este PROTOCol fornece instruções passo-a-passo sobre como conseguir cardiomiócitos viáveis de ratos adultos que podem ser usados tanto para curto prazo, bem como investigações de longo prazo. Cardiomiócitos isolados usando este protocolo pode ser eficientemente transduzidas com vetores adenovirais 20,21 e cultivadas durante semanas. Estes métodos proporcionam um sistema poderoso para estudar a biologia dos cardiomiócitos in vitro.
Os métodos aqui descritos são baseados em vários elementos de obras anteriores usando variações da perfusão retrógrada Langendorff. 18,22 Apesar de vários protocolos foram publicados sobre o isolamento dos cardiomiócitos de rato adulto para a cultura de curto prazo e de estudo, a vantagem de 23-25 este protocolo é a capacidade de cultura do isolado cardiomiócitos longo prazo. Isso será útil no estudo de processos celulares que envolvem a expressão de genes ectópicos e que requerem períodos de tempo prolongados, tais como em estratégias de reprogramação celulares.
Protocol
Representative Results
Discussion
A saúde geral dos cardiomiócitos isolados depende de vários aspectos importantes deste protocolo. Em primeiro lugar, o tempo de extracção coração a perfusão é crítica e deve ser realizado em 5 minutos ou menos. A remoção do cálcio ajuda a dissociar as interacções célula-célula, mas podem ter um impacto negativo a saúde das células a longo prazo. 29-32 Assim, considera-se suficiente para remover o cálcio durante os primeiros poucos minutos de perfusão de EGTA (ácido tetracético de etilen…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este projecto foi financiado pelo Programa de UCSF para Breakthrough Biomedical Research (financiado em parte pela Fundação Sandler), o NIH Pathway to Prêmio Independência (R00HL114738), e da Fundação Edward Mallinckrodt Jr.. JJ foi apoiado por uma bolsa de pós-doutorado do NIH (T32HL007731). Os autores são os únicos responsáveis pelo conteúdo deste trabalho, o que não representa necessariamente a posição oficial do NIH.
Materials
| Equipment | |||
| Heated water jacket | Radnoti | 158831 | |
| Circulating heated water bath, Isotemp | Fisher Scientific | 3013 | |
| Laboratory pump | Watson-Marlow | 323 | |
| Hemostats | Exelta | 63042-090 | |
| Tissue forceps | VWR | 470128034 | |
| Dumont #7 curved forceps | FST | 91197-00 | |
| Dumont #5 fine forceps | FST | 11251-20 | |
| Small dissection scissors | VWR | 470128034 | |
| Extra fine bonn scissors | FST | 14084-08 | |
| Fine spring scissors | FST | 91500-09 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| Na2HPO4-7H2O | Fisher | S25837 | |
| MgSO4-7H2O | Fisher | S25414 | |
| Taurine | Sigma | 86329 | |
| Butane dione monoxime (BDM) | Sigma | B0753 | |
| HEPES | Fisher | BP310100 | |
| Glucose | Sigma | G-7021 | |
| Insulin | Novo Nordisk | 393153 | |
| EGTA | Amresco | 0732-288 | |
| Protease, type XIV | Sigma | P5147 | |
| Collagenase II | Worthington | LS004176 | |
| MEM | Corning | 15-010-CV | |
| FBS, heat inactivated | JRS | 43613 | |
| Primocin | Invitrogen | NC9141851 | |
| Ethyl Carbamate | Alfa Aesar | AAA44804-18 | |
| 215 micron mesh | Component supply | U-CMN-215-A | |
| 20 G blunt ended needle | Becton Dickinson | 305183 | |
| 20 G beveled needle | Becton Dickinson | 305176 | |
| Lab tape | VWR | 89097-990 | |
| Surgical tape | 3M | 1527-0 | |
| Silk suture, 7-0 | Teleflex | 15B051000 | |
| Mouse anti-alpha-actinin antibody | Sigma | A7811 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1 antibody | Thermo Fisher | A21121 |
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