Aislamiento, cultivo y la transducción de cardiomiocitos de ratones adultos
Summary
This protocol describes a step-by-step method for the reproducible isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes with high yield, purity, and viability.
Abstract
Cultivos de cardiomiocitos se pueden utilizar para estudiar la biología de los cardiomiocitos usando técnicas que son complementarios a los sistemas in vivo. Por ejemplo, la pureza y la accesibilidad de cultivo in vitro permite un control preciso sobre los análisis bioquímicos, imágenes en vivo, y electrofisiología. cultivo a largo plazo de los cardiomiocitos ofrece acceso a los enfoques experimentales adicionales que no se pueden completar en cultivos de corto plazo. Por ejemplo, la investigación in vitro de desdiferenciación, ciclo celular de reentrada, y la división celular hasta el momento ha sido en gran parte restringido a los cardiomiocitos de rata, que parecen ser más robusto en cultivo a largo plazo. Sin embargo, la disponibilidad de un amplio conjunto de herramientas de líneas de ratones transgénicos modelos de enfermedad y bien desarrollados sistemas de ratón hacen atractiva para la investigación cardiaca. Aunque existen varios informes del aislamiento de los cardiomiocitos de ratón adulto, pocos estudios demuestran su cultivo a largo plazo. Se presenta aquí, es un método paso a paso para elel aislamiento y la cultura a largo plazo de los cardiomiocitos de ratones adultos. En primer lugar, retrógrada perfusión Langendorff se utiliza para digerir de manera eficiente el corazón con proteasas, seguido de purificación gravedad sedimentación. Después de un período de desdiferenciación después del aislamiento, las células se unen gradualmente a la cultura y pueden ser cultivadas durante semanas. lisado celular Adenovirus se utiliza para transducir eficientemente los cardiomiocitos aislados. Estos métodos proporcionan un potente sistema simple, modelo para estudiar la biología cardiaco.
Introduction
Cultivos de cardiomiocitos se utilizan con frecuencia para controlar el comportamiento celular en un entorno bien controlado in vitro. Por ejemplo, las propiedades de células morfológicas, eléctricos, bioquímicos o mecánicos pueden ser estudiados en sustratos de ingeniería, 1,2 en medios definidos, y en respuesta a fármacos de moléculas pequeñas, péptidos, regulación génica, 3 o estimulación eléctrica. 4 El contenido celular pueden también se controlan mediante co-cultivos definidos. 5 Estos experimentos in vitro son útiles en grandes pantallas de drogas o genéticos y complementan los métodos in vivo para diversos tipos de investigaciones relacionadas con la biología de los cardiomiocitos.
cultivo a largo plazo permite avenidas experimentales que requieren largos períodos de tiempo para lograr un cambio fenotípico. Un ejemplo oportuno es el de la proliferación de los cardiomiocitos de los mamíferos adultos, donde desdiferenciación, el ciclo celular de reentrada, y la división celular típicamente se estudiaron más de síVeral días a semanas 6,7. En este caso, el tiempo de cultivo extendido facilita la manipulación genética, 7,8 desdiferenciación funcional (por ejemplo, el desmontaje del sarcómero) 9 y desdiferenciación potencialmente transcripcional. 6 subsiguiente ciclo celular de reentrada y la división celular requiere períodos de cultivo aún más largos observar, sobre todo si múltiples rondas de división son el objetivo experimental. La importancia del ciclo celular de cardiomiocitos es central para varios trabajos científicos reciente de la clave en la regeneración del corazón, donde el desdiferenciación y proliferación de cardiomiocitos pre-existentes ha demostrado responsable de la regeneración del corazón en el pez cebra y ratones neonatales. 10-12 Por lo tanto, la posibilidad para estimular la desdiferenciación del ciclo celular y la reentrada en cardiomiocitos adultos de mamíferos sigue siendo una cuestión clave en la regeneración del corazón humano 13-15
E n experimentos in vitro que estudian el ciclo celular de los mamíferos cardiomiocitos han utilizado predominantemente fuentes de rata, debido a su relativa facilidad de cultivo a largo plazo en comparación con los modelos de ratón. 16 Sin embargo, los sistemas murinos ofrecen una rica fuente de herramientas transgénicas bien caracterizados y modelos de enfermedad que son útiles en tanto in vitro como in vivo protocolos. Por ejemplo, el trazado de linaje basado-Cre ha permitido la identificación de los cardiomiocitos pre-existentes como una fuente de regeneración de miocardio en el corazón neonatal de ratón in vivo. 12 Estudios in vitro de linaje de trazado de los cardiomiocitos de ratones neonatales han permitido el estudio de las interacciones con estroma células a través de co-cultivo con fibroblastos. 5 Sin embargo, debido a sus retos, existen pocos informes 17 del aislamiento y la cultura a largo plazo de los cardiomiocitos de ratones adultos. 18,19
El aislamiento de los cardiomiocitos viables de ratón adulto de cultivo a corto plazo solo se sabe que es una tarea difícil. este protocol proporciona instrucciones paso a paso sobre cómo lograr los cardiomiocitos viables de ratones adultos que pueden ser utilizados tanto para corto plazo, así como las investigaciones a largo plazo. Cardiomiocitos aislados utilizando este protocolo pueden ser transducidas eficientemente con vectores adenovirales 20,21 y cultivadas durante semanas. Estos métodos proporcionan un potente sistema para estudiar la biología de los cardiomiocitos in vitro.
Los métodos descritos en este documento se basan en varios elementos de obras anteriores utilizando variaciones de la perfusión retrógrada Langendorff. 18,22 Aunque varios protocolos se han publicado sobre el aislamiento de cardiomiocitos adultos de ratón para el cultivo a corto plazo y el estudio, la ventaja de 23-25 este protocolo es la capacidad de la cultura del cardiomiocitos aislados a largo plazo. Esto será útil en el estudio de los procesos celulares que implican la expresión de genes ectópico y que requieren períodos prolongados de tiempo, tales como en las estrategias de reprogramación celular.
Protocol
Representative Results
Discussion
El estado general de salud de los cardiomiocitos aislados depende de varios aspectos importantes de este protocolo. En primer lugar, el tiempo de la extracción del corazón a la perfusión es crítica y debe realizarse en 5 min o menos. La eliminación de calcio ayuda a disociar las interacciones célula-célula, pero puede tener un impacto negativo en la salud celular a largo plazo. 29-32 Por lo tanto, les resulta suficiente para eliminar el calcio durante los primeros pocos minutos de perfusión de EGTA (?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este proyecto fue financiado por el Programa de Investigación Biomédica UCSF Avance (financiado en parte por la Fundación Sandler), el NIH Camino al Premio de la Independencia (R00HL114738), y la Fundación Edward Mallinckrodt Jr. JJ fue apoyado por una beca postdoctoral de los NIH (T32HL007731). Los autores son los únicos responsables de los contenidos de este trabajo, que no necesariamente representan la opinión oficial de los NIH.
Materials
| Equipment | |||
| Heated water jacket | Radnoti | 158831 | |
| Circulating heated water bath, Isotemp | Fisher Scientific | 3013 | |
| Laboratory pump | Watson-Marlow | 323 | |
| Hemostats | Exelta | 63042-090 | |
| Tissue forceps | VWR | 470128034 | |
| Dumont #7 curved forceps | FST | 91197-00 | |
| Dumont #5 fine forceps | FST | 11251-20 | |
| Small dissection scissors | VWR | 470128034 | |
| Extra fine bonn scissors | FST | 14084-08 | |
| Fine spring scissors | FST | 91500-09 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| Na2HPO4-7H2O | Fisher | S25837 | |
| MgSO4-7H2O | Fisher | S25414 | |
| Taurine | Sigma | 86329 | |
| Butane dione monoxime (BDM) | Sigma | B0753 | |
| HEPES | Fisher | BP310100 | |
| Glucose | Sigma | G-7021 | |
| Insulin | Novo Nordisk | 393153 | |
| EGTA | Amresco | 0732-288 | |
| Protease, type XIV | Sigma | P5147 | |
| Collagenase II | Worthington | LS004176 | |
| MEM | Corning | 15-010-CV | |
| FBS, heat inactivated | JRS | 43613 | |
| Primocin | Invitrogen | NC9141851 | |
| Ethyl Carbamate | Alfa Aesar | AAA44804-18 | |
| 215 micron mesh | Component supply | U-CMN-215-A | |
| 20 G blunt ended needle | Becton Dickinson | 305183 | |
| 20 G beveled needle | Becton Dickinson | 305176 | |
| Lab tape | VWR | 89097-990 | |
| Surgical tape | 3M | 1527-0 | |
| Silk suture, 7-0 | Teleflex | 15B051000 | |
| Mouse anti-alpha-actinin antibody | Sigma | A7811 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1 antibody | Thermo Fisher | A21121 |
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