Isolering, kultur och Transduction av vuxna möss Cardiomyocytes
Summary
This protocol describes a step-by-step method for the reproducible isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes with high yield, purity, and viability.
Abstract
Odlade kardiomyocyter kan användas för att studera cardiomyocyte biologi med användning av tekniker som är komplementära till in vivo-system. Till exempel möjliggör renhet och tillgänglighet av in vitro-kultur fin kontroll över biokemiska analyser, levande avbildning och elektrofysiologi. Långvarig odling av kardiomyocyter ger tillgång till ytterligare experimentella metoder som inte kan slutföras i kortsiktiga kulturer. Till exempel, utredningen av dedifferentiering, cellcykel återinträde, och celldelning in vitro hittills i stort sett begränsade till råttkardiomyocyter, som verkar vara mer robust i långtidsodling. Men det finns en rik verktygslåda av transgen mus linjer och välutvecklade sjukdomsmodeller gör mus system attraktivt för hjärtforskning. Trots att flera rapporter finns om vuxna möss cardiomyocyte isolering, några studier visar deras långsiktiga kultur. Presenteras här, är en steg-för-steg-metod förisolering och långsiktig odling av vuxen mus cardiomyocytes. Först retrograd Langendorff perfusion användas för att effektivt smälta hjärtat med proteaser, följt av gravitationssedimente rening. Efter en period av dedifferentiering efter isolering, cellerna successivt fästa till odlingen och kan odlas i flera veckor. Adenovirus cellysat används för att på ett effektivt sätt omvandla de isolerade cardiomyocytes. Dessa metoder ger en enkel, men ändå kraftfullt modellsystem för att studera hjärt biologi.
Introduction
Odlade kardiomyocyter används ofta för att övervaka cellens beteende i en väl kontrollerad miljö in vitro. Till exempel, kan morfologiska, elektriska, biokemiska eller mekaniska cellegenskaper studeras på manipulerade substrat, 1,2 i definierade medier, och som svar på småmolekylära läkemedel, peptider, genreglering, 3 eller elektrisk stimulering. 4 Det cellulära innehållet kan även styras med definierade co-kulturer. 5 Dessa in vitro-försök är användbara i stora läkemedel eller genetiska skärmar och kompletterar in vivo-metoder för olika typer av undersökningar med cardiomyocyte biologi.
Långvarig odling möjliggör experimentella vägar som kräver längre tid för att uppnå fenotypisk förändring. Ett aktuellt exempel är att vuxna däggdjur cardiomyocyte spridning, där dedifferentiering, cellcykel återinträde, och celldelning normalt studeras över sigVeral dagar till veckor. 6,7 Här underlättar den förlängda odlingstiden genetisk manipulation, 7,8 funktionell dedifferentiering (t.ex. sarcomeric demontering) 9 och eventuellt transkriptions dedifferentiering. 6 Efterföljande cellcykel återinträde och celldelning kräver ännu längre odlingsperioder att observera, särskilt om flera omgångar av division är den experimentella målet. Vikten av cardiomyocyte cellcykeln är central för flera nya viktiga vetenskapliga arbeten i hjärtat förnyelse, där dedifferentiering och spridning av befintliga kardiomyocyter har visat ansvarig för hjärt förnyelse i zebrafisk och neonatala möss. 10-12 således möjligheten att stimulera dedifferentiering och cellcykel återinträde i däggdjurs vuxna cardiomyocytes fortfarande en viktig fråga i människohjärtat regenere 13-15
I n vitro-experiment som studerar cellcykeln av däggdjurs hjärtmyocyter har främst används råttkällor på grund av sin relativa enkelhet av långtidsodling jämfört med musmodeller. 16 emellertid murina system erbjuder en rik resurs välkarakteriserade transgena verktyg och sjukdomsmodeller som är användbara i både in vitro och in vivo protokoll. Till exempel har Cre-baserade härstamning spårning möjliggjorde identifiering av befintliga kardiomyocyter som en källa att regenerera hjärtmuskeln i neonatal mus hjärtat in vivo. 12 In vitro-studier av Lineage-spårade neonatal mus cardiomyocytes har gjort det möjligt att undersöka interaktioner med stromal celler genom samodling med fibroblaster. 5 på grund av dess utmaningar existerar för isolering och långsiktig odling av vuxen mus cardiomyocytes 17 fåtal rapporter. 18,19
Isolering av livskraftiga vuxen mus kardiomyocyter för enbart kortsiktiga kultur är känd för att vara en utmanande uppgift. denna protocol ger steg-för-steg-instruktioner om hur man kan uppnå livskraftiga hjärtmuskelceller från vuxna möss som kan användas för både kortsiktiga och långsiktiga undersökningar. Kardiomyocyter isolerade med hjälp av detta protokoll kan effektivt omvandlas med adenovirusvektorer 20,21 och odlade i flera veckor. Dessa metoder ger ett kraftfullt system för att studera cardiomyocyte biologi in vitro.
De metoder som beskrivs här baseras på flera element från tidigare arbeten med hjälp av varianter av Langendorff retrograd perfusion. 18,22 Även om flera protokoll har publicerats på isolering av vuxna mus cardiomyocytes för kortsiktiga kultur och studera, 23-25 fördelen med detta protokoll är förmågan att odla isolerade kardiomyocyter långsiktigt. Detta kommer att vara användbara vid studium av cellulära processer som involverar ektopisk genuttryck och kräver långa tidsperioder, såsom i cellulära omprogrammering strategier.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den allmänna hälsan hos de isolerade kardiomyocyter beror på flera viktiga aspekter av detta protokoll. Först, tiden från hjärtat utvinning till perfusion är kritisk och bör utföras i 5 min eller mindre. Borttagning av kalcium bidrar till att dissociera cell-cell interaktioner, men kan negativt påverka cell hälsa på lång sikt. 29-32 Därför finner vi det tillräckligt att avlägsna kalcium under de första minuterna av perfusion med EGTA (etylenglykol-tetraättiksyra) kelatering, 22 m…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Projektet har finansierats av UCSF Program för Genombrott biomedicinsk forskning (finansieras delvis av Sandler Foundation), NIH Pathway to Independence Award (R00HL114738) och Edward Mallinckrodt Jr. Foundation. JJ stöddes av en postdoktorsstipendium från NIH (T32HL007731). Författarna är ensam ansvarig för innehållet i detta arbete, vilket inte nödvändigtvis representerar officiella ståndpunkter NIH.
Materials
| Equipment | |||
| Heated water jacket | Radnoti | 158831 | |
| Circulating heated water bath, Isotemp | Fisher Scientific | 3013 | |
| Laboratory pump | Watson-Marlow | 323 | |
| Hemostats | Exelta | 63042-090 | |
| Tissue forceps | VWR | 470128034 | |
| Dumont #7 curved forceps | FST | 91197-00 | |
| Dumont #5 fine forceps | FST | 11251-20 | |
| Small dissection scissors | VWR | 470128034 | |
| Extra fine bonn scissors | FST | 14084-08 | |
| Fine spring scissors | FST | 91500-09 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| Na2HPO4-7H2O | Fisher | S25837 | |
| MgSO4-7H2O | Fisher | S25414 | |
| Taurine | Sigma | 86329 | |
| Butane dione monoxime (BDM) | Sigma | B0753 | |
| HEPES | Fisher | BP310100 | |
| Glucose | Sigma | G-7021 | |
| Insulin | Novo Nordisk | 393153 | |
| EGTA | Amresco | 0732-288 | |
| Protease, type XIV | Sigma | P5147 | |
| Collagenase II | Worthington | LS004176 | |
| MEM | Corning | 15-010-CV | |
| FBS, heat inactivated | JRS | 43613 | |
| Primocin | Invitrogen | NC9141851 | |
| Ethyl Carbamate | Alfa Aesar | AAA44804-18 | |
| 215 micron mesh | Component supply | U-CMN-215-A | |
| 20 G blunt ended needle | Becton Dickinson | 305183 | |
| 20 G beveled needle | Becton Dickinson | 305176 | |
| Lab tape | VWR | 89097-990 | |
| Surgical tape | 3M | 1527-0 | |
| Silk suture, 7-0 | Teleflex | 15B051000 | |
| Mouse anti-alpha-actinin antibody | Sigma | A7811 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1 antibody | Thermo Fisher | A21121 |
Riferimenti
- Patel, A. K., Celiz, A. D., et al. A defined synthetic substrate for serum free culture of human stem cell derived cardiomyocytes with improved functional maturity identified using combinatorial materials microarrays. Biomaterials. 61, 257-265 (2015).
- Mathur, A., Loskill, P., et al. Human iPSC-based Cardiac Microphysiological System For Drug Screening Applications. Sci Rep. 5, 8883 (2015).
- Mahmoud, A. I., Kocabas, F., et al. Meis1 regulates postnatal cardiomyocyte cell cycle arrest. Nature. 497 (7448), 249-253 (2013).
- Baumgartner, S., Halbach, M., et al. Electrophysiological and morphological maturation of murine fetal cardiomyocytes during electrical stimulation in vitro. J Cardiovasc Pharmacol Ther. 20 (1), 104-112 (2015).
- Ieda, M., Tsuchihashi, T., et al. Cardiac fibroblasts regulate myocardial proliferation through beta1 integrin signaling. Dev Cell. 16 (2), 233-244 (2009).
- Zhang, Y., Li, T. S., et al. Dedifferentiation and proliferation of mammalian cardiomyocytes. PLoS One. 5 (9), e12559 (2010).
- Engel, F. B., Schebesta, M., et al. p38 MAP kinase inhibition enables proliferation of adult mammalian cardiomyocytes. Gene Dev. 19 (10), 1175-1187 (2005).
- Sakurai, T., Lanahan, A., Woolls, M. J., Li, N., Tirziu, D., Murakami, M. Live cell imaging of primary rat neonatal cardiomyocytes following adenoviral and lentiviral transduction using confocal spinning disk microscopy. J Vis Exp. (88), e51666 (2014).
- Ahuja, P., Perriard, E., Perriard, J. C., Ehler, E. Sequential myofibrillar breakdown accompanies mitotic division of mammalian cardiomyocytes. J Cell Sci. 117 (Pt 15), 3295-3306 (2004).
- Kikuchi, K., Holdway, J. E., et al. Primary contribution to zebrafish heart regeneration by gata4(+) cardiomyocytes. Nature. 464 (7288), 601-605 (2010).
- Jopling, C., Sleep, E., Raya, M., Martì, M., Raya, A., Izpisúa Belmonte, J. C. Zebrafish heart regeneration occurs by cardiomyocyte dedifferentiation and proliferation. Nature. 464 (7288), 606-609 (2010).
- Porrello, E. R., Mahmoud, A. I., et al. Transient Regenerative Potential of the Neonatal Mouse Heart. Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).
- Heallen, T., Morikawa, Y., et al. Hippo signaling impedes adult heart regeneration. Development. 140 (23), 4683-4690 (2013).
- Lin, Z., Zhou, P., et al. Pi3kcb links Hippo-YAP and PI3K-AKT signaling pathways to promote cardiomyocyte proliferation and survival. Circ Res. 116 (1), 35-45 (2015).
- Zebrowski, D. C., Vergarajauregui, S., et al. Developmental alterations in centrosome integrity contribute to the post-mitotic state of mammalian cardiomyocytes. eLife. 4, e05563 (2015).
- Schluter, K. D., Piper, H. M. . Practical Methods in Cardiovascular Research. , (2005).
- Zhou, Y. Y., Wang, S. Q., et al. Culture and adenoviral infection of adult mouse cardiac myocytes: methods for cellular genetic physiology. Am J Physiol Heart Circ Phys. 279 (1), H429-H436 (2000).
- Kruppenbacher, J. P., May, T., Eggers, H. J., Piper, H. M. Cardiomyocytes of adult mice in long-term culture. Naturwissenschaften. 80 (3), 132-134 (1993).
- Fredj, S., Bescond, J., Louault, C., Potreau, D. Interactions between cardiac cells enhance cardiomyocyte hypertrophy and increase fibroblast proliferation. Journal of Cellular Physiology. 202 (3), 891-899 (2005).
- Li, Z., Sharma, R. V., Duan, D., Davisson, R. L. Adenovirus-mediated gene transfer to adult mouse cardiomyocytes is selectively influenced by culture medium. J Gene Med. 5 (9), 765-772 (2003).
- Luo, J., Deng, Z. L., et al. A protocol for rapid generation of recombinant adenoviruses using the AdEasy system. Nat Protoc. 2 (5), 1236-1247 (2007).
- Shioya, T. A simple technique for isolating healthy heart cells from mouse models. J Physiol Sci. 57 (6), 327-335 (2007).
- Li, D., Wu, J., Bai, Y., Zhao, X., Liu, L. Isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy. J Vis Exp. (87), e51357 (2014).
- Wolska, B. M., Solaro, R. J. Method for isolation of adult mouse cardiac myocytes for studies of contraction and microfluorimetry. Am J Physiol Heart Circ Phys. 271 (3), H1250-H1255 (1996).
- Pinz, I., Zhu, M., Mende, U., Ingwall, J. S. An improved isolation procedure for adult mouse cardiomyocytes. Cell Biochem Biophys. 61 (1), 93-101 (2011).
- Di Stefano, V., Giacca, M., Capogrossi, M. C., Crescenzi, M., Martelli, F. Knockdown of cyclin-dependent kinase inhibitors induces cardiomyocyte re-entry in the cell cycle. J Biol Chem. 286 (10), 8644-8654 (2011).
- Malouf, N. N., McMahon, D., Oakeley, A. E., Anderson, P. A. A cardiac troponin T epitope conserved across phyla. J Biol Chem. 267 (13), 9269-9274 (1992).
- Ehler, E., Moore-Morris, T., Lange, S. Isolation and culture of neonatal mouse cardiomyocytes. J Vis Exp. (79), e50154 (2013).
- Daly, M. J., Elz, J. S., Nayler, W. G. Contracture and the calcium paradox in the rat heart. Circ Res. 61 (4), 560-569 (1987).
- Piper, H. Culturing of calcium stable adult cardiac myocytes. J Mol Cell Cardiol. 14 (7), 397-412 (1982).
- Ashraf, M. Correlative studies on sarcolemmal ultrastructure, permeability, and loss of intracellular enzymes in the isolated heart perfused with calcium-free medium. Am J Pathol. 97 (2), 411-432 (1979).
- Piper, H. The calcium paradox revisited An artefact of great heuristic value. Cardiovasc Res. 45 (1), 123-127 (2000).
- Higuchi, H., Takemori, S. Butanedione monoxime suppresses contraction and ATPase activity of rabbit skeletal muscle. J Biochem. 105 (4), 638-643 (1989).
- Rother, J., Richter, C., et al. Crosstalk of cardiomyocytes and fibroblasts in co-cultures. Open biology. 5 (6), 150038 (2015).
- Fujio, Y., Nguyen, T., Wencker, D., Kitsis, R. N., Walsh, K. Akt Promotes Survival of Cardiomyocytes In Vitro and Protects Against Ischemia-Reperfusion Injury in Mouse Heart. Circulation. 101 (6), 660-667 (2000).
- Dambrot, C., Braam, S. R., Tertoolen, L. G. J., Birket, M., Atsma, D. E., Mummery, C. L. Serum supplemented culture medium masks hypertrophic phenotypes in human pluripotent stem cell derived cardiomyocytes. Journal of cellular and molecular medicine. 18 (8), 1509-1518 (2014).
- Karliner, J. S., Simpson, P. C., Taylor, J. E., Honbo, N., Woloszyn, W. Adrenergic receptor characteristics of cardiac myocytes cultured in serum-free medium: Comparison with serum-supplemented medium. Biochemical and Biophysical Research Communications. 128 (1), 376-382 (1985).
- Zheng, X., Baker, H., Hancock, W. S., Fawaz, F., McCaman, M., Pungor, E. Proteomic analysis for the assessment of different lots of fetal bovine serum as a raw material for cell culture. Part IV. Application of proteomics to the manufacture of biological drugs. Biotechnology progress. 22 (5), 1294-1300 (2006).
- Soonpaa, M. H., Kim, K. K., Pajak, L., Franklin, M., Field, L. J. Cardiomyocyte DNA synthesis and binucleation during murine development. Am J Physiol. 271 (5 Pt 2), H2183-H2189 (1996).
- Engel, F. B., Hsieh, P. C. H., Lee, R. T., Keating, M. T. FGF1/p38 MAP kinase inhibitor therapy induces cardiomyocyte mitosis, reduces scarring, and rescues function after myocardial infarction. P Natl Acad Sci USA. 103 (42), 15546-15551 (2006).
- Tian, Y., Liu, Y., et al. A microRNA-Hippo pathway that promotes cardiomyocyte proliferation and cardiac regeneration in mice. Sci Transl Med. 7 (279), 279ra38 (2015).
- Soonpaa, M. H., Koh, G. Y., et al. Cyclin D1 overexpression promotes cardiomyocyte DNA synthesis and multinucleation in transgenic mice. J Clin Invest. 99 (11), 2644-2654 (1997).
- Stewart, S., Stankunas, K. Limited dedifferentiation provides replacement tissue during zebrafish fin regeneration. Dev Biol. 365 (2), 339-349 (2012).
- Wu, C. H., Huang, T. Y., Chen, B. S., Chiou, L. L., Lee, H. S. Long-Duration Muscle Dedifferentiation during Limb Regeneration in Axolotls. PLoS One. 10 (2), e0116068 (2015).
- Nag, A. C., Lee, M. L., Kosiur, J. R. Adult cardiac muscle cells in long-term serum-free culture: myofibrillar organization and expression of myosin heavy chain isoforms. In vitro cellular & developmental biology journal of the Tissue Culture Association. 26 (5), 464-470 (1990).
- Lian, X., Hsiao, C., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. P Natl Acad Sci USA. 109 (27), E1848-E1857 (2012).
- Sohal, D. S., Nghiem, M., et al. Temporally Regulated and Tissue-Specific Gene Manipulations in the Adult and Embryonic Heart Using a Tamoxifen-Inducible Cre Protein. Circ Res. 89 (1), 20-25 (2001).
- Hsieh, P. C. H., Segers, V. F. M., et al. Evidence from a genetic fate-mapping study that stem cells refresh adult mammalian cardiomyocytes after injury. Nat Med. 13 (8), 970-974 (2007).
