개발 및 특성화의<em> 체외</em> 미세 혈관 네트워크 및 내피의 정량적 측정 [칼슘<sup> 2 +</sup>]<sub> 전</sub> 및 질소 산화물 생산
Summary
Primary human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were grown to confluence within a microfluidic network device. The endothelial cell junction and F-actin distributions were illustrated and the changes in intracellular calcium concentration and nitric oxide production in response to adenosine triphosphate (ATP) were quantified in real-time at individual cell levels.
Abstract
생체 내에서 혈관 벽을 라이닝 내피 세포 (EC에)는 끊임없이 유동에 노출되어 있지만, 배양되는 EC 종종 정적 조건 하에서 성장 및 염증성 표현형을 나타내고있다. 미세 유체 장치의 개발이 20 년간 엔지니어들이 채택되었지만, 생물학적 응용은 제한 남아있다. 생물학적 응용 프로그램에 의해 검증보다 생리 학적으로 관련 시험 관내 미세 혈관 모델들이 필드에 발전 생체 사이 시험관 연구에서 격차를 해소하는 것이 중요하다. 여기서는 장기 관류 용량을 갖는 미세 유동 장치를 이용하여 배양 된 미세 혈관 네트워크의 개발을위한 상세한 절차를 제시한다. 또한, 종래의 공 초점 및 형광 현미경을 사용하여 실시간으로 EC [칼슘] i 및 산화 질소 (NO)의 생산에서 작용제 – 유도 변화의 정량적 측정을위한 응용 프로그램을 보여준다. 형성된 미세 혈관 순연속 관류와 작업이되는 EC 사이의 잘 발달 된 접합을 보여 주었다. 분포를-cadherin의 VE 것은 정적 배양 EC 단층보다 그대로 미세 혈관에서 관찰에 가까운이었다. EC의 일시적인 증가가 유도 ATP [CA는 2+] i 및 NO 생산은 정량적 배양 된 미세 혈관의 기능을 검증 개별 셀 레벨에서 측정되었다. 이 마이크로 유체 장치는 내장 컴퓨터가 기존의 정적 2D 문화보다 생체 내에서의 세포 배양 환경을 가까이하게 잘 조절, 생리 학적으로 관련 흐름에 따라 증가 할 수 있습니다. 마이크로 채널 네트워크 설계 다용도이며, 제조 공정이 단순하고 반복적이다. 이 장치는 쉽게 고해상도 영상화를 가능하게하는 공 초점 현미경 또는 종래의 시스템에 통합 될 수있다. 배양 된 미세 혈관 네트워크가 일차 인간 EC에 의해 형성 될 수 있기 때문에, 가장 중요한 것은,이 방법은 방법을 조사하기 위해 유용한 도구가 될 것병리학 적으로 환자 샘플에서 변경된 혈액 성분은 인간의 내장 컴퓨터에 영향을 미치는 임상 문제에 대한 통찰력을 제공합니다. 또한, 약물 스크리닝을위한 플랫폼으로 개발 될 수있다.
Introduction
생체 내에서 혈관 벽을 라이닝 내피 세포 (EC에)는 끊임없이 유동에 노출되어 있지만, 배양되는 EC 종종 정적 조건 하에서 성장 및 염증성 표현형 1,2 나타내고있다. 미세 유체 기술은 원하는 유량 조건 하에서 성장하기 위하여, 특히 혈관의 EC를 들어, 세포 배양을위한 기회를 제공하는 마이크로 기하학적 제약 (서브 밀리미터) 채널 (3)을 통해 유체를 정밀하게 제어 할 수있다. 이러한 기능은 기존의 정적 차원 세포 배양에 비해 생체 내에서의 세포 배양 조건을 가까이합니다. 그들은 마이크로 유체 장치 vasculatures의 다른 유형을 모델링하는 데 사용되는 기계적 및 / 또는 화학적 자극에 대한 EC의 반응을 연구 할 때 매우 중요하다.
정적 세포 배양, 생물 의학 F의 적응과 미세 유체의 응용 프로그램을 통해 마이크로 네트워크에 의해 입증 장점에도 불구하고의 ield 제한 남아있다. 최근의 검토에 의해보고되는 경우,이 필드 (85 %)의 서적의 대부분은 공학 저널 (4)에 정지한다. 미세 유체 장치의 성능은 대부분의 생물 학자들이 같은 트랜스 웰 분석이 소형 장치에 매크로 규모의 배양 접시 / 유리 슬라이드로 현재 기술로 전환하기에 충분한 납득되지 않았습니다. 미세 유체 앞으로이 필드를 이동하는 학제 간 협력을 필요로하는 종합 분야입니다. 이 기술 문서의 목적은 생물학적 응용 및 미세 미세 혈관의 기능 검증을 제공하면서, 기술 분야 사이의 갭을 감소시키고 생물에 의한 제조 방법을 이해할 수 있도록하는 것이다. 시각화 실험 프로토콜은 마이크로 유체 장치 및 엔지니어와 생물 학자들 사이의 긴밀한 협력을 나타내는 생물학적 유틸리티, 모두의 제조를 포함한다.
우리는 최근 몇 가지를보고미세 유동 장치 (5) 시험 관내 미세 혈관 망을 이용하여 생물학적 응용. 적절히 원하는 전단 응력을 마이크로 네트워크의 치수를 설계 및 적용하기 위해서, 수치적인 모델 밀접 유량 프로파일을 추정하는 전산 유체 역학 소프트웨어를 사용하여 구축 하였다. 즉, 합류에 도달 마이크로에 접종 한 기본 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVECs를)은 연속 관류 3-4 일, 마이크로의 전체 내부 표면에 덮여있다. 적절한 배리어 형성 정적 세포 배양 조건에서 미세 혈관 손상에 형성된 것과 비교 VE-cadherin의 염색에 의해 증명되었다. 개별적으로 관류 그대로 미세 혈관 6-8에서 개발 된 실험 프로토콜을 적용하여, 우리는 정량적으로 EC의 변화를 측정 [칼슘 2 +] i와 산화 질소 (NO) 형광에서와 아데노신 삼인산 (ATP)에 응답하여 생산에 모아와 공 초점 및 기존의 형광 현미경. EC의 효능 유발 증가 [칼슘 2 +] i와 NO 생산은 미세 혈관 투과성 6-15에 염증 매개체에 의한 증가에 필요한 세포 내 신호로보고되고있다. 일부 이전 연구는 DAF-2 DA로드 미세 유체 장치 (16, 17)의 이미지를 보여 주었다 있지만, 적절한 해상도와 데이터 분석은 아직 18을 달성하지 않았다. 우리의 지식으로,이 연구는 내피 세포에 작용 물질에 의한 동적 변화 [칼슘 2 +] i와 NO 생산 이용한 미세 유체 기반 시스템의 첫 번째 양적 측정을 보여줍니다.
미세 가공 기술이 몇 마이크론 마이크로 채널을 제조 및 생체 내 미세 혈관의 형상을 모방하는 복잡한 패턴의 개발을 가능하게 할 수있는 유연성을 가지고있다. 여기에서 우리는 분기의 세 가지 수준으로 일반적인 마이크로 채널 네트워크를 발표했다. 이네트워크는 미세 크린룸 소프트 리소그래피에서 수행되는 리소그래피의 조합에 의해 제조된다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 글에서, 우리는 배양 된 미세 혈관 네트워크의 개발을위한 상세한 프로토콜을 제시, EC 접합 및 F-굴지의 유통 세포 골격 특성화 및 EC의 정량적 측정 [칼슘 2 +] i와 미세 유체 장치를 이용하여 NO 생산. 관류 미세 유체 장치는 생체 내 미세 혈관 형상과 전단 유동 조건의 가까운 시뮬레이션을 허용하는 체외 모델을 제공합니다. 배양 된 미세 혈관 네트워크가 일차…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 국립 심장, 폐, 혈액 연구소에 의해 지원되었다 HL56237, 당뇨병과 소화기의 국립 연구소 및 신장 질환 연구소 DK97391-03, 국립 과학 재단 (NSF-1227359 및 EPS-1003907)를 부여합니다.
Materials
| ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| Acetone | Fisher Scientific | A929 | |
| Biopsy punch | Miltex | 33-31 AA | |
| Bovine Albumin | MP Biomedicals | 810014 | |
| Bovine Brain Extract (BBE) | Lonza | CC-4098 | |
| Cover-slip | Fisher Scientific | 12-542C | |
| DAF-2 DA | Calbiochem | 251505 | |
| Dextran | Sigma-Aldrich | 31390 | |
| Donkey anti-Goat IgG (H+L) Secondary Antibody | Life technologies | A-11055 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190-250 | |
| DRAQ5 (nuclei staining) | Cell Signaling Technology | 4084 | |
| Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS) | Sigma-Aldrich | E2759-15MG | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000-044 | |
| Fibronectin | Gibco | PHE0023 | |
| Fluo-4 AM | Life technologies | F-14201 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890-100G | |
| Gentamicin (50 mg/mL) | Gibco | 15750-078 | |
| Glass coverslip | Fisher Scientific | 12-548B | |
| Glass Pasteur pippette | VWR | 14672 | |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | H3393-10KU | |
| HEPES Buffered Saline Solution | Lonza | CC-5024 | |
| Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) | Lonza | CC-2517 | |
| Isopropyl alcohol (IPA) | VWR | 89125 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030-081 | |
| Mammalian Ringer Solution Ingredient | |||
| NaCl (132 mM) | Fisher Scientific | S671-3 | |
| KCL (4.6 mM) | Fisher Scientific | P217-500 | |
| CaCl2 · 2H2O (2.0 mM) | Fisher Scientific | C79-500 | |
| MgSO4 ·7H2O (1.2 mM) | Fisher Scientific | M63-500 | |
| Glucose(5.5 mM) | Fisher Scientific | BP350-1 | |
| NaHCO3 (5.0 mM) | Fisher Scientific | S233-500 | |
| Hepes Salt (9.1 mM) | Research Organics | 6007H | |
| Hepes Acid (10.9 mM) | Research Organics | 6003H | |
| MCDB 131 Culture Medium | Life technologies | 10372-019 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Phalloidin (F-actin staining) | Sigma-Aldrich | P1951 | |
| Phosphate Buffered Saline | Life technologies | 14040-133 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning Corporation | Sylgard 184 | |
| Scalpel | Exel Int | 29552 | |
| Scotch tape | 3M | 34-8711-3070-3 | |
| Silicon wafer | VWR | 14672 | |
| SU-8 photoresist | MicroChem | SU-8 2050 Y111072 | |
| SU-8 developer | MicroChem | Y020100 | |
| tissue culture flasks | Sigma-Aldrich | Z707503-100EA | |
| Triton X-100 | Chemical Book | T6878 | |
| Trypsin Neutralizer solution | Gibco | R-002-100 | |
| Trypsin/EDTA Solution (TE) | Gibco | R-001-100 | |
| Tubing | Cole-Parmer | PTFE microbore tubing, 0.012" ID x 0.030" OD | |
| VE-cadherin | Santa Cruz Biotechnology | SC-6458 | |
| Name of Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Biosafety Laminar hood | NuAire | NU-425 Class II, Type A2 | |
| CCD camera | Hamamatsu | ORCA | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SL | |
| Desiccator | Bel-Art | F42022 | |
| Hotplate | Wenesco | HP-1212 | |
| Incubator | Forma Scientific | 3110 | |
| Isotemp oven | Barnstead | 3608-5 | |
| Lithography bench | Karl Suss | MA6 Contact Lithography | |
| Optical microscope | Nikon | L200 ND & Diaphod 300 | |
| Shutter for the CCD camera | Sutter Instrument | Lambda 10-2 | |
| Plasma cleaner | PVA TePla/Harrick plasma | M4L/PDC-32G | |
| Spin coater | Brewer Science | Cee 200X | |
| Syringe pump system | Harvard Apparatus | 703005 | |
| Name of Software | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| CAD software | Autodesk | AutoCAD 2015 | |
| CFD simulation software | COMSOL | COMSOL Multiphysics 4.0.0.982 | |
| Images acquire and analyse for NO production | Universal Imaging | Metafluor |
Riferimenti
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