JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Medicina

הסתיידות של לתאי השריר החלק בכלי הדם והדמיה של אבי העורקים הסתיידות ודלקת

Published: May 31, 2016
doi:
10.3791/54017
, , , , , , , , , , , , , , , , , , ,
1Anesthesia Center for Critical Care Research of the Department of Anesthesia, Critical Care, and Pain Medicine,Massachusetts General Hospital, 2Cardiovascular Research Center and Cardiology Division of the Department of Medicine,Massachusetts General Hospital, 3Cardiovascular Division,Brigham and Women’s Hospital, 4Harvard Medical School, 5Department of Anesthesiology,Uniklinik RWTH Aachen, RWTH Aachen University, 6Center for Immunology and Inflammatory Diseases and the Division of Rheumatology, Allergy, and Immunology of the Department of Medicine,Massachusetts General Hospital

Summary

Vascular calcification is an important predictor of and contributor to human cardiovascular disease. This protocol describes methods for inducing calcification of cultured primary vascular smooth muscle cells and for quantifying calcification and macrophage burden in animal aortas using near-infrared fluorescence imaging.

Abstract

Cardiovascular disease is the leading cause of morbidity and mortality in the world. Atherosclerotic plaques, consisting of lipid-laden macrophages and calcification, develop in the coronary arteries, aortic valve, aorta, and peripheral conduit arteries and are the hallmark of cardiovascular disease. In humans, imaging with computed tomography allows for the quantification of vascular calcification; the presence of vascular calcification is a strong predictor of future cardiovascular events. Development of novel therapies in cardiovascular disease relies critically on improving our understanding of the underlying molecular mechanisms of atherosclerosis. Advancing our knowledge of atherosclerotic mechanisms relies on murine and cell-based models. Here, a method for imaging aortic calcification and macrophage infiltration using two spectrally distinct near-infrared fluorescent imaging probes is detailed. Near-infrared fluorescent imaging allows for the ex vivo quantification of calcification and macrophage accumulation in the entire aorta and can be used to further our understanding of the mechanistic relationship between inflammation and calcification in atherosclerosis. Additionally, a method for isolating and culturing animal aortic vascular smooth muscle cells and a protocol for inducing calcification in cultured smooth muscle cells from either murine aortas or from human coronary arteries is described. This in vitro method of modeling vascular calcification can be used to identify and characterize the signaling pathways likely important for the development of vascular disease, in the hopes of discovering novel targets for therapy.

Introduction

מחלות לב וכלי דם הוא הגורם לתחלואה ותמותה המובילות בעולם, כולל ארצות הברית, שם היא מהווה מעל 780,000 מקרי מוות בשנה. 1 הסתיידות עורקים כליליים הסתיידות העורקים הם מסימני ההיכר של טרשת עורקים ולשמש מנבאים חזקים של אירועים קרדיווסקולריים. 2- 4 שני סוגים עיקריים של הסתיידות כלי הדם דווחו במבוגרים: הסתיידות intimal, הקשורים טרשת עורקים, המדיאלי (הידוע גם בשם Mönckeberg) הסתיידות, הקשורים למחלת כליות כרונית וסוכרת 5 הסתיידות intimal מתרחשת על רקע של הצטברות שומנים מקרופאג. החדרתם בדפנות כלי הדם. 5,6 הסתיידות הקיר המדיאלי מתרחשת באופן עצמאי של הסתיידות intimal, לוקליזציה לסיבי האלסטין או תאי שריר חלק, והוא לא קשור בתצהיר השומנים או חדירה מקרופאג. 5,7,8 מחקרים על המנגנונים המולקולריים שלהסתיידות כלי דם יש לסמוך על מערכות מודל מבוססי תאים ובבעלי חיים. מודלים מכרסמים למחלת atherocalcific כוללים עכברים חסר או אפוליפופרוטאין E (APOE) 9,10 או קולטן ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה (LDLR) 11 שקיבלו תזונה עשירה בשומן, בעוד מודלים הסתיידות המדיאלי כוללים עכברים עם חלבון מטריקס GLA (MGP) חסר 12 או חולדות לפתח uremia באמצעות כריתת כליה כמעט מוחלטת (מודל כריתת הכליה 5/6) או על ידי חשיפת דיאטה עתירה אדנין. 13

כאן, המודל של הסתיידות כלי דם המדיאלי הקשורים מחסור MGP מתמקד. MGP הוא חלבון תאיים המעכבת הסתיידות עורקים. 12 מוטציות בגן MGP זוהו תסמונת Keutel, למחלה אנושית נדירה המאופיינת הסתיידות הסחוס מפוזר בנוסף brachytelephalangy, אובדן שמיעה, היצרות ריאתי הפריפריה. 14-18 למרות שלא לעתים קרובות ציינו, 19הסתיידות קונצנטריים של העורקים מרובים תוארה תסמונת Keutel. 20 פולימורפיזם Common בגן MGP אדם קשורים לסיכון מוגבר הסתיידות עורקים כליליים, 21-23 בעוד שרמות במחזור גבוה של uncarboxylated, MGP פעיל ביולוגית לחזות התמותה ממחלת לב כלילית. 24 בניגוד לבני אדם עם תסמונת Keutel, עכברים MGP מחסר לפתח פנוטיפ כלי הדם חמורה המורכב הסתיידות עורקים נפוצה ספונטנית החל שבועיים של להזדקן ולמות 6-8 שבועות לאחר הלידה עקב קרע באבי העורקים. 12

בניגוד ApoE – / – ו LDLR – / – עכברים שקיבלו תזונה עשירה בשומן, אשר לפתח הסתיידות כלי הדם intimal עם דלקת מקרופאג הנגרמת הקשורים, MGP – / -. עכברים לפתח הסתיידות כלי הדם המדיאלי בהעדר חדירה מקרופאג 11,25 למרות ממצאים אלה מראים גירויים בסיסיים שונים עבור intimאל ו הסתיידות המדיאלי, קיימת חפיפה במנגנוני איתות כי לתווך שתי צורות של הסתיידות. 26 מסלולי איתות מרובים זוהו שתורמים הסתיידות כלי הדם כולל מתווכים דלקתיים כגון-α גורם נמק הגידול ו- IL-1 וגורמים פרו-osteogenic כגון Notch, Wnt, וחלבון העצם המוךפו"גנטי שהולך (BMP) איתות. 27,28 מסלולי איתות אלו להגדיל הביטוי של גורמי שעתוק גורם שעתוק הקשורות גמד 2 (Runx2) ו osterix, אשר בתורו להגדיל ביטוי של חלבונים הקשורים העצם ( . למשל, osteocalcin, sclerostin, ו phosphatase אלקליין) בכלי הדם אשר מתווכים הסתיידות 28-30 אנו ואחרים הוכיחו כי הסתיידות כלי הדם שנצפתה ApoE – / – ו LDLR – / – עכברים שקיבלו תזונה עשירה בשומן ואת ספונטנית הסתיידות כלי הדם שנצפתה MGP – / – עכברים הכל תלוי חלבון המוךפו"גנטי שהולך העצם (BMP) סיgnaling, וזה מסלול זה כי הוא התמקד כאן. 11,25,31 BMPs גורמי osteogenic חזקים הנדרשים היווצרות עצם ידוע להפגין ביטוי מוגבר טרשת עורקי אדם. 32-34 במבחנה יש מעורב איתות BMP בויסות הביטוי של גורמים osteogenic כגון Runx2. 35-37 התבטאות יתר של ליגנד BMP, BMP-2, מאיצה את הפיתוח של הסתיידות כלי הדם בעכברים ApoE לקוי שקיבלו תזונה שומן גבוה. 38 יתר על כן, השימוש הספציפי BMP איתות מעכבי כזה כמו LDN-193,189 (LDN) 39,40 ו / או ALK3-Fc מונע התפתחות של הסתיידות כלי הדם בשני LDLR – / – עכברים שקיבלו תזונה עשירה בשומן ועכברים MGP מחסר 11,25.

תאי דם שריר חלק (VSMCs) יש תפקיד קריטי בהתפתחות של הסתיידות כלי דם. 30,41,42 הסתיידות כלי הדם המדיאלי שמתפתחת MGP מחסר עכברים הוא characterized ידי transdifferentiation של VSMCs כדי פנוטיפ osteogenic. הפסד של תוצאות MGP בביטוי ירידה של סמנים VSMC כולל myocardin אקטין שריר חלק אלפא, עם עלייה מקבילה סמנים osteogenic כגון Runx2 ו osteopontin. שינויים אלה עולים בקנה אחד עם הפיתוח של הסתיידות כלי דם. 25,43,44

הסתיידות ודלקת אבי העורקים בעכברים מוערכים בדרך כלל תוך שימוש בטכניקות histochemical כגון פעילות phosphatase אלקליין עבור הסתיידות מוקדם ופעילות osteogenic, פון Kossa ו Alizarin מכתים אדום עבור הסתיידות מאוחר, ופרוטוקולים immunohistochemical כי למקד סמנים חלבוניים מקרופאג (למשל., CD68, F4 / 80, Mac-1, Mac-2, Mac-3). 9,45 עם זאת, שיטות הדמיה סטנדרטיות אלו דורשים עיבוד של רקמות העורקים לתוך חתכים, מה שגוזל זמן רב ולא מושלם בשל דגימה מוטה, ו מוגבלים שלהם היכולת לכמת דלקת calcificatיון באבי העורקים כולו. פרוטוקול זה מתאר שיטה כדי לחזות ולכמת הסתיידות עורקים אבי העורקים ובינוניים כולו וצבירת מקרופאג ניצול פלורסנט קרוב אינפרא אדום (ניר) הדמיה מולקולרית vivo לשעבר. גם סיפק היא שיטה להכנת זרעים culturing VSMCs אבי העורקים הראשי מעכברים זירוז הסתיידות של murine ו VSMCs אדם במבחנה כדי לקבוע את המנגנונים המולקולריים שבבסיס הסתיידות כלי הדם. טכניקות אלה מספקים את החוקר עם הן in vivo ו בשיטות במבחנה לחקר מחלת atherocalcific.

Protocol

כל המחקרים שנעשו בעכברים בוצעו בהתאם קפדנית עם ההמלצות מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה של המכון הלאומי לבריאות בארה"ב. שיכון כל הנהלים הקשורים עכברים המתוארים במחקר זה אושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש ועדות של החולים הכללי במסצ'וסטס (ועדת המשנה על מח?…

Representative Results

הסתיידות עורקים ב MGP – / – ו עכברי-בר נמדדה באמצעות הדמיה של קרינת NIR סידן. אין אות NIR סידן זוהתה aortas מעכברי wild-type, המציינת את עדר ההסתיידות (איור 2). אות NIR סידן חזקה זוהתה aortas מעכברי MGP המחסר, אשר עולה בקנה אחד עם הסתיידות כלי דם מתקדמת. קטעי a…

Discussion

הסתיידות העורקים היא גורם סיכון חשוב למחלות לב וכלי דם בבני אדם ועשויים לתרום ישירות בפתוגנזה של אירועים קרדיווסקולריים. 1,5,52 בתצהיר סידן intimal ב כיפה סיבית דקה של מחלת טרשת עורקים הוצע להגדיל מתח ביומכנית המקומי ולתרום קרע פלאק. 53,54 משפיע הסתיידות המדיאלי …

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the Sarnoff Cardiovascular Research Foundation (MFB and TET), the Howard Hughes Medical Institute (TM), the Ladue Memorial Fellowship Award from Harvard Medical School (DKR), the START-Program of the Faculty of Medicine at RWTH Aachen (MD), the German Research Foundation (DE 1685/1-1, MD), the National Eye Institute (R01EY022746, ESB), the Leducq Foundation (Multidisciplinary Program to Elucidate the Role of Bone Morphogenetic Protein Signaling in the Pathogenesis of Pulmonary and Systemic Vascular Diseases, PBY, KDB, and DBB), the National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases (R01AR057374, PBY), the National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (R01DK082971, KDB and DBB), the American Heart Association Fellow-to-Faculty Award #11FTF7290032 (RM), and the National Heart, Lung, and Blood Institute (R01HL114805 and R01HL109506, EA; K08HL111210, RM).

Materials

15 ml conical tube Falcon 352096
30 G needle BD 305106
Alpha smooth muscle actin antibody Sigma SAB2500963
Chamber slide Nunc Lab-Tek 154461
Collagenase, Type 2  Worthington LS004176
Dexamethasone Sigma D4902
Dulbecco's Modified Eagle Medium Life Technologies 11965-084
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, no calcium Gibco 14190-144
Elastase Sigma E1250
Fetal bovine serum Gibco 16000-044
Forceps, fine point Roboz RS-4972
Forceps, full curve serrated Roboz RS-5138
Formalin (10%) Electron Microscopy Sciences 15740
Hank's Balanced Salt Solution Gibco 14025-092
Human coronary artery smooth muscle cells PromoCell C-12511
Insulin syringe with needle Terumo SS30M2913
L-ascorbic acid Sigma A-7506
Micro-dissecting spring scissors (13mm) Roboz RS-5676
Micro-dissecting spring scissors (3mm) Roboz RS-5610
NIR, cathepsin (ProSense-750EX) Perkin Elmer NEV10001EX
NIR, osteogenic (OsteoSense-680EX) Perkin Elmer NEV10020EX
Normal Saline Hospira 0409-4888-10
Nuclear fast red Sigma-Aldrich N3020
Odyssey Imaging System Li-Cor Odyssey 3.0
Penicillin/Streptomycin Corning 30-001-CI
Silver nitrate (5%) Ricca Chemical Company 6828-16
Sodium phosphate dibasic heptahydrate Sigma-Aldrich S-9390
Sodium thiosulfate Sigma S-1648
ß-glycerophosphate disodium salt hydrate Sigma G9422
Tissue culture flask, 25 cm2 Falcon 353108
Tissue culture plate (35mm x 10mm) Falcon 353001
Tissue culture plate, six-well Falcon 353046
Trypsin Corning 25-053-CI
Tube rodent holder Kent Scientific RSTR551
Vacuum-driven filtration system Millipore SCGP00525
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Go, A. S., et al. Heart disease and stroke statistics–2014 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 129 (3), e28-e292 (2014).
  2. Wilson, P. W., et al. Abdominal aortic calcific deposits are an important predictor of vascular morbidity and mortality. Circulation. 103 (11), 1529-1534 (2001).
  3. Budoff, M. J., et al. Assessment of coronary artery disease by cardiac computed tomography: a scientific statement from the American Heart Association on Committee on Cardiovascular Imaging and Intervention, Council on Cardiovascular Radiology and Intervention, and Committee on Cardiac Imaging, Council on Clinical Cardiology. Circulation. 114 (16), 1761-1791 (2006).
  4. Greenland, P., LaBree, L., Azen, S. P., Doherty, T. M., Detrano, R. C. Coronary artery calcium score combined with Framingham score for risk prediction in asymptomatic individuals. Jama. 291 (2), 210-215 (2004).
  5. Otsuka, F., Sakakura, K., Yahagi, K., Joner, M., Virmani, R. Has our understanding of calcification in human coronary atherosclerosis progressed?. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34 (4), 724-736 (2014).
  6. Virmani, R., Burke, A. P., Farb, A., Kolodgie, F. D. Pathology of the vulnerable plaque. J Am Coll Cardiol. 47 (8 Suppl), C13-C18 (2006).
  7. Amann, K. Media calcification and intima calcification are distinct entities in chronic kidney disease. Clin J Am Soc Nephrol. 3 (6), 1599-1605 (2008).
  8. Aikawa, E., et al. Arterial and aortic valve calcification abolished by elastolytic cathepsin S deficiency in chronic renal disease. Circulation. 119 (13), 1785-1794 (2009).
  9. Aikawa, E., et al. Osteogenesis associates with inflammation in early-stage atherosclerosis evaluated by molecular imaging in vivo. Circulation. 116 (24), 2841-2850 (2007).
  10. Qiao, J. H., et al. Pathology of atheromatous lesions in inbred and genetically engineered mice. Genetic determination of arterial calcification. Arterioscler Thromb. 14 (9), 1480-1497 (1994).
  11. Derwall, M., et al. Inhibition of bone morphogenetic protein signaling reduces vascular calcification and atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 32 (3), 613-622 (2012).
  12. Luo, G., et al. Spontaneous calcification of arteries and cartilage in mice lacking matrix GLA protein. Nature. 386 (6620), 78-81 (1997).
  13. Shobeiri, N., Adams, M. A., Holden, R. M. Vascular calcification in animal models of CKD: A review. Am J Nephrol. 31 (6), 471-481 (2010).
  14. Keutel, J., Jorgensen, G., Gabriel, P. [A new autosomal-recessive hereditary syndrome. Multiple peripheral pulmonary stenosis, brachytelephalangia, inner-ear deafness, ossification or calcification of cartilages]. Dtsch Med Wochenschr. 96 (43), 1676-1681 (1971).
  15. Munroe, P. B., et al. Mutations in the gene encoding the human matrix Gla protein cause Keutel syndrome. Nat Genet. 21 (1), 142-144 (1999).
  16. Cormode, E. J., Dawson, M., Lowry, R. B. Keutel syndrome: clinical report and literature review. Am J Med Genet. 24 (2), 289-294 (1986).
  17. Fryns, J. P., van Fleteren, A., Mattelaer, P., van den Berghe, H. Calcification of cartilages, brachytelephalangy and peripheral pulmonary stenosis. Confirmation of the Keutel syndrome. Eur J Pediatr. 142 (3), 201-203 (1984).
  18. Ozdemir, N., et al. Tracheobronchial calcification associated with Keutel syndrome. Turk J Pediatr. 48 (4), 357-361 (2006).
  19. Cranenburg, E. C., et al. Circulating matrix gamma-carboxyglutamate protein (MGP) species are refractory to vitamin K treatment in a new case of Keutel syndrome. J Thromb Haemost. 9 (6), 1225-1235 (2011).
  20. Meier, M., Weng, L. P., Alexandrakis, E., Ruschoff, J., Goeckenjan, G. Tracheobronchial stenosis in Keutel syndrome. Eur Respir J. 17 (3), 566-569 (2001).
  21. Wang, Y., et al. Common genetic variants of MGP are associated with calcification on the arterial wall but not with calcification present in the atherosclerotic plaques. Circ Cardiovasc Genet. 6 (3), 271-278 (2013).
  22. Cassidy-Bushrow, A. E., et al. Matrix gla protein gene polymorphism is associated with increased coronary artery calcification progression. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33 (3), 645-651 (2013).
  23. Crosier, M. D., et al. Matrix Gla protein polymorphisms are associated with coronary artery calcification in men. J Nutr Sci Vitaminol (Tokyo). 55 (1), 59-65 (2009).
  24. Liu, Y. P., et al. Inactive matrix Gla protein is causally related to adverse health outcomes: a Mendelian randomization study in a Flemish population. Hypertension. 65 (2), 463-470 (2015).
  25. Malhotra, R., et al. Inhibition of bone morphogenetic protein signal transduction prevents the medial vascular calcification associated with matrix Gla protein deficiency. PLoS One. 10 (1), e0117098 (2015).
  26. Demer, L. L., Tintut, Y. Inflammatory, metabolic, and genetic mechanisms of vascular calcification. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34 (4), 715-723 (2014).
  27. Rusanescu, G., Weissleder, R., Aikawa, E. Notch signaling in cardiovascular disease and calcification. Curr Cardiol Rev. 4 (3), 148-156 (2008).
  28. Leopold, J. A. Vascular calcification: Mechanisms of vascular smooth muscle cell calcification. Trends Cardiovasc Med. 25 (4), 267-274 (2015).
  29. Bostrom, K. I., Rajamannan, N. M., Towler, D. A. The regulation of valvular and vascular sclerosis by osteogenic morphogens. Circ Res. 109 (5), 564-577 (2011).
  30. Hruska, K. A., Mathew, S., Saab, G. Bone morphogenetic proteins in vascular calcification. Circ Res. 97 (2), 105-114 (2005).
  31. Yao, Y., et al. Inhibition of bone morphogenetic proteins protects against atherosclerosis and vascular calcification. Circ Res. 107 (4), 485-494 (2010).
  32. Bostrom, K., et al. Bone morphogenetic protein expression in human atherosclerotic lesions. J Clin Invest. 91 (4), 1800-1809 (1993).
  33. Bragdon, B., et al. Bone morphogenetic proteins: a critical review. Cell Signal. 23 (4), 609-620 (2011).
  34. Cai, J., Pardali, E., Sanchez-Duffhues, G., ten Dijke, P. BMP signaling in vascular diseases. FEBS Lett. 586 (14), 1993-2002 (2012).
  35. Lee, K. S., et al. Runx2 is a common target of transforming growth factor beta1 and bone morphogenetic protein 2, and cooperation between Runx2 and Smad5 induces osteoblast-specific gene expression in the pluripotent mesenchymal precursor cell line C2C12. Mol Cell Biol. 20 (23), 8783-8792 (2000).
  36. Matsubara, T., et al. BMP2 regulates Osterix through Msx2 and Runx2 during osteoblast differentiation. J Biol Chem. 283 (43), 29119-29125 (2008).
  37. Li, X., Yang, H. Y., Giachelli, C. M. BMP-2 promotes phosphate uptake, phenotypic modulation, and calcification of human vascular smooth muscle cells. Atherosclerosis. 199 (2), 271-277 (2008).
  38. Nakagawa, Y., et al. Paracrine osteogenic signals via bone morphogenetic protein-2 accelerate the atherosclerotic intimal calcification in vivo. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 30 (10), 1908-1915 (2010).
  39. Cuny, G. D., et al. Structure-activity relationship study of bone morphogenetic protein (BMP) signaling inhibitors. Bioorg Med Chem Lett. 18 (15), 4388-4392 (2008).
  40. Yu, P. B., et al. BMP type I receptor inhibition reduces heterotopic ossification. Nat Med. 14 (12), 1363-1369 (2008).
  41. Schurgers, L. J., Uitto, J., Reutelingsperger, C. P. Vitamin K-dependent carboxylation of matrix Gla-protein: a crucial switch to control ectopic mineralization. Trends Mol Med. 19 (4), 217-226 (2013).
  42. Speer, M. Y., et al. Smooth muscle cells give rise to osteochondrogenic precursors and chondrocytes in calcifying arteries. Circ Res. 104 (6), 733-741 (2009).
  43. Speer, M. Y., Li, X., Hiremath, P. G., Giachelli, C. M. Runx2/Cbfa1 but not loss of myocardin, is required for smooth muscle cell lineage reprogramming toward osteochondrogenesis. J Cell Biochem. 110 (4), 935-947 (2010).
  44. Steitz, S. A., et al. Smooth muscle cell phenotypic transition associated with calcification: upregulation of Cbfa1 and downregulation of smooth muscle lineage markers. Circ Res. 89 (12), 1147-1154 (2001).
  45. Inoue, T., Plieth, D., Venkov, C. D., Xu, C., Neilson, E. G. Antibodies against macrophages that overlap in specificity with fibroblasts. Kidney Int. 67 (6), 2488-2493 (2005).
  46. Zaheer, A., et al. In vivo near-infrared fluorescence imaging of osteoblastic activity. Nat Biotechnol. 19 (12), 1148-1154 (2001).
  47. Aikawa, E., et al. Multimodality molecular imaging identifies proteolytic and osteogenic activities in early aortic valve disease. Circulation. 115 (3), 377-386 (2007).
  48. Lee, K. J., Czech, L., Waypa, G. B., Farrow, K. N. Isolation of pulmonary artery smooth muscle cells from neonatal mice. J Vis Exp. (80), e50889 (2013).
  49. Tang, Y., Herr, G., Johnson, W., Resnik, E., Aho, J. Induction and analysis of epithelial to mesenchymal transition. J Vis Exp. (78), (2013).
  50. Puchtler, H., Meloan, S. N. Demonstration of phosphates in calcium deposits: a modification of von Kossa’s reaction. Histochemistry. 56 (3-4), 177-185 (1978).
  51. Krahn, K. N., Bouten, C. V., van Tuijl, S., van Zandvoort, M. A., Merkx, M. Fluorescently labeled collagen binding proteins allow specific visualization of collagen in tissues and live cell culture. Anal Biochem. 350 (2), 177-185 (2006).
  52. Johnson, R. C., Leopold, J. A., Loscalzo, J. Vascular calcification: pathobiological mechanisms and clinical implications. Circ Res. 99 (10), 1044-1059 (2006).
  53. Vengrenyuk, Y., et al. A hypothesis for vulnerable plaque rupture due to stress-induced debonding around cellular microcalcifications in thin fibrous caps. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (40), 14678-14683 (2006).
  54. Maldonado, N., et al. A mechanistic analysis of the role of microcalcifications in atherosclerotic plaque stability: potential implications for plaque rupture. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 303 (5), H619-H628 (2012).
  55. Toussaint, N. D., Kerr, P. G. Vascular calcification and arterial stiffness in chronic kidney disease: implications and management. Nephrology (Carlton). 12 (5), 500-509 (2007).
  56. Vines, D. C., Green, D. E., Kudo, G., Keller, H. Evaluation of mouse tail-vein injections both qualitatively and quantitatively on small-animal PET tail scans. J Nucl Med Technol. 39 (4), 264-270 (2011).
  57. Smith, J. G., et al. Association of low-density lipoprotein cholesterol-related genetic variants with aortic valve calcium and incident aortic stenosis. Jama. 312 (17), 1764-1771 (2014).
  58. Thanassoulis, G., et al. Genetic associations with valvular calcification and aortic stenosis. N Engl J Med. 368 (6), 503-512 (2013).
  59. Otto, C. M., Kuusisto, J., Reichenbach, D. D., Gown, A. M., O’Brien, K. D. Characterization of the early lesion of ‘degenerative’ valvular aortic stenosis. Histological and immunohistochemical studies. Circulation. 90 (2), 844-853 (1994).
  60. New, S. E., Aikawa, E. Molecular imaging insights into early inflammatory stages of arterial and aortic valve calcification. Circ Res. 108 (11), 1381-1391 (2011).
  61. Jaffer, F. A., Libby, P., Weissleder, R. Optical and multimodality molecular imaging: insights into atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 29 (7), 1017-1024 (2009).
  62. Stern, P. H. Antiresorptive agents and osteoclast apoptosis. J Cell Biochem. 101 (5), 1087-1096 (2007).
  63. Ray, J. L., Leach, R., Herbert, J. M., Benson, M. Isolation of vascular smooth muscle cells from a single murine aorta. Methods Cell Sci. 23 (4), 185-188 (2001).
  64. Chamley-Campbell, J., Campbell, G. R., Ross, R. The smooth muscle cell in culture. Physiol Rev. 59 (1), 1-61 (1979).
  65. Trion, A., Schutte-Bart, C., Bax, W. H., Jukema, J. W., van der Laarse, A. Modulation of calcification of vascular smooth muscle cells in culture by calcium antagonists, statins, and their combination. Mol Cell Biochem. 308 (1-2), 25-33 (2008).
  66. Mori, K., Shioi, A., Jono, S., Nishizawa, Y., Morii, H. Dexamethasone enhances In vitro vascular calcification by promoting osteoblastic differentiation of vascular smooth muscle cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 19 (9), 2112-2118 (1999).
  67. Thyberg, J. Differentiated properties and proliferation of arterial smooth muscle cells in culture. Int Rev Cytol. 169, 183-265 (1996).
  68. Dinardo, C. L., et al. Vascular smooth muscle cells exhibit a progressive loss of rigidity with serial culture passaging. Biorheology. 49 (5-6), 365-373 (2012).
  69. Metz, R. P., Patterson, J. L., Wilson, E. Vascular smooth muscle cells: isolation, culture, and characterization. Methods Mol Biol. 843, 169-176 (2012).
  70. Proudfoot, D., Shanahan, C. Human vascular smooth muscle cell culture. Methods Mol Biol. 806, 251-263 (2012).
  71. Hruska, K. A. Vascular smooth muscle cells in the pathogenesis of vascular calcification. Circ Res. 104 (6), 710-711 (2009).

Tags

Vascular CalcificationAortic CalcificationVascular Smooth Muscle CellsAortaIn VivoEx VivoInflammationMacrophageAtherosclerosisCalciumCathepsinImagingFluorescence Imaging

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
O’Rourke, C., Shelton, G., Hutcheson, J. D., Burke, M. F., Martyn, T., Thayer, T. E., Shakartzi, H. R., Buswell, M. D., Tainsh, R. E., Yu, B., Bagchi, A., Rhee, D. K., Wu, C., Derwall, M., Buys, E. S., Yu, P. B., Bloch, K. D., Aikawa, E., Bloch, D. B., Malhotra, R. Calcification of Vascular Smooth Muscle Cells and Imaging of Aortic Calcification and Inflammation. J. Vis. Exp. (111), e54017, doi:10.3791/54017 (2016).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image