En enzym- og Serum-fri neural stamcelle Culture Model for EMT Investigation Egnet til Drug Discovery
Summary
Epithelial to mesenchymal transition (EMT) allows cancers to become invasive. To investigate EMT, a neural stem cell (NSC)-based in vitro model devoid of serum and enzymes is described. This standardized system allows quantitative and qualitative assessment of cell migration, gene and protein expression. The model is suited for drug discovery.
Abstract
Epiteliale til mesenkymale overgang (EMT) beskriver processen med epitel transdifferentiating ind mesenchyme. EMT er en grundlæggende proces under fosterudviklingen, der også ofte forekommer i glioblastom, den hyppigste maligne hjernetumor. EMT er også blevet observeret i flere carcinomer uden for hjernen, herunder brystcancer, lungecancer, coloncancer, gastrisk cancer. EMT er centralt forbundet med malignitet ved at fremme migration, invasion og metastase-dannelse. Mekanismerne i EMT-induktion er ikke fuldt forstået. Her beskriver vi et in vitro system til standardiseret isolering af corticale neurale stamceller (NSC) og efterfølgende EMT-induktion. Dette system giver fleksibilitet til at bruge enten enkelte celler eller eksplantation kultur. I dette system rotte eller mus embryonale forhjerne NSC'er dyrkes i et defineret medium, blottet for serum og enzymer. De NSC'er udtrykte Olig2 og Sox10, to transkriptionsfaktorer observeret i oligodendrocYTE precursorceller (OPCs). Med dette system interaktioner mellem FGF-, BMP- og TGF-signalering involverer Zeb1, Zeb2, og Twist2 blev observeret hvor TGFp-aktivering signifikant forøget cellemigration, hvilket antyder en synergistisk BMP- / TGFp-interaktion. Resultaterne peger på et netværk af FGF-, BMP- og TGF-signalering at være involveret i EMT induktion og vedligeholdelse. Dette modelsystem er relevant at undersøge EMT in vitro. Det er omkostningseffektiv og viser høj reproducerbarhed. Det giver også mulighed for sammenligning af forskellige forbindelser med hensyn til deres migration reaktioner (kvantitativ måling af afstand), og high-throughput screening af forbindelser til at inhibere eller forøge EMT (kvalitativ måling). Modellen er derfor velegnet til at teste drug biblioteker for stoffer, der påvirker EMT.
Introduction
Under flere stadier af fosterudviklingen, epitelceller mister deres stærke tilslutning til hinanden (f.eks tætte forbindelser) og erhverve en vandrende fænotype i en proces kaldet epitelial til mesenkymale overgang (EMT) 1. EMT er nødvendig for dannelsen af yderligere celletyper, såsom mesenkymale crista neuralis-celler, en population, der segregerer fra neuroepithelium 2. EMT er ikke kun vigtigt i fosterstadiet, men også nødvendig på senere stadier af voksne liv til at opretholde fysiologiske processer i den voksne organisme, såsom sårheling 3 og centralnervesystemet (CNS) regenerering i demyeliniserende læsioner 4.
Epiteliale tumorer er kendt for at genaktivere EMT som en indvielse skridt for migration, invasion og metastase, i sidste ende fører til kræft progression 1,3. EMT er faktisk centralt forbundet med stærk migration 1,3. De cellulære trinnene conditioning, initiering, gennemgår og vedligeholdelse EMT er ikke fuldt forstået, og har brug for yderligere undersøgelser.
Her er en standardiseret in vitro EMT model baseret på NSC, med definerede vækstfaktorer og medier (ingen serum og ingen brug enzym) præsenteres. Denne model system er af relevans for forskere, der arbejder på EMT. Sneglen, Zeb og Twist protein familier har vist sig at være kritisk for EMT både i udvikling og sygdom 1. Sneglen, Zeb og Twist familier er også involveret i den præsenterede system. Systemet er baseret på en specifik region af forhjernen, der normalt ikke undergår EMT giver en særlig fordel for studiet af indledende begivenheder under EMT induktion.
Modelsystemet kan potentielt anvendes til at studere EMT i epitel uden for CNS, idet centrale EMT induktorer som sneglen, Zeb og Twist proteiner, bliver også fundet under EMT i vævs- systemer uden for CNS. Denne model system tillader standardiseret isolering af NSC'er fra udviklingslandene cortex at studere stamcellelinjer funktioner i almindelighed og EMT i særdeleshed. Anvendelse af dette system, vi isoleret NSC'er, induceret EMT og studerede efterfølgende migrering under indvirkning af FGF2 og BMP4. Vi observerede, FGF- og BMP-signalering interagerer med TGFp-signalering at fremme cellemigration, derved valideret modelsystemet.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne undersøgelse et standardiseret system til EMT analyse under anvendelse NSC'er er beskrevet (opsummeret i supplerende figur 3). Standardiseringen sikrer reproducerbarhed (tabel 1 og 2). De NSC'er stammer fra det udviklende cortex, et væv, der normalt ikke undergår EMT. Dette er en fordel for analysen af de tidlige stadier af EMT. Indledende skridt i EMT kan ikke tilstrækkeligt undersøgt hos tumorceller, der har akkumuleret genetiske ændringer og kan allerede v…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Undersøgelsen blev støttet af universitetet i Basel Science Foundation og den schweiziske National Science Foundation med et tilskud til MHS og AG (SNF IZLIZ3_157230). Vi takker: Dr. Tania Rinaldi Burkat for generøst leverer infrastruktur alle medlemmer af Bettler gruppen for diskussioner og kommentarer. Vi takker Gerhard Dorne (Leica Microsystems, Schweiz) til professionel og kompetent installation af Full HD MC170 videokamera (Leica Microsystems, Schweiz).
Materials
| BMP4, rhBMP4 | RnD Systems | 314-BP-01M | |
| Bovine pancreas insulin | Sigma | I1882 | |
| Boyden chamber, CytoSelect cell invasion assay | Cell Biolabs | CBA-110 | 24 well plate system |
| Cell culture dish with grid | Ibidi 500 mm dish, 35 mm | 80156 | |
| CellMask Orange | Life Technologies | C10045 | Plasma membrane dye, use at 1:1000 . |
| DAPI | LifeTechnologies | D1306 | Stock at 5mg/ml. Use at 1:10000. Cancerogenic. Appropriate protection (gloves, coat, goggles) required. |
| DMEM/F12 1:1 medium bottle | Gibco Invitrogen | 21331-020 | |
| FGF2, rhFGF2 | RnD Systems | 233-FB-01M | |
| Fibronectine, bovine | Sigma | F4759 | |
| Glutamax supplement | Gibco Invitrogen | 35050-061 | |
| Graphics software with pixel measurement feature | Fiji | fiji.sc/Fiji | version 2.0.0-rc-30/1.49s |
| HBSS media | Sigma | H9394 | |
| Human apo-Transferrin | Sigma | T1147 | Possible lung irritant. Avoid inhalation. Use appropriate protection. |
| L-glutamine | Gibco Invitrogen | 25030-024 | |
| Nestin, Mouse anti Nestin antibody | Genetex | GTX26142 | Use at 1:100, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1% |
| Olig2, Rabbit anti Olig2 antibody | Provided by Hirohide Takebayash | Personal stock | Use at 1:2000, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1% |
| Penicillin/Streptomycin/Fungizone | Gibco Invitrogen | 15240-062 | |
| Podoplanin, Mouse anti Podoplanin antibody | Acris | DM3614P | Use at 1:250, 4% PFA fixation, avoid Triton X100 |
| Poly-L-ornithine | Sigma | P3655 | |
| Putrescine | Sigma | P5780 | Skin and eye irritant. Appropriate protection required. |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| Sox10, Rabbit anti Sox10 antibody | Millipore Chemicon | AB5774 | Use at 1:200, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1% |
| TGFb1, rhTGFb1 | RnD Systems | 240-B-010 | |
| Uncoated Petri dishes | Falcon Corning | 351029 |
Riferimenti
- Nieto, M. A. Epithelial-Mesenchymal Transitions in development and disease: old views and new perspectives. Int J Dev Biol. 53, 1541-1547 (2009).
- Sauka-Spengler, T., Bronner-Fraser, M. A gene regulatory network orchestrates neural crest formation. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 557-568 (2008).
- Barriere, G., Fici, P., Gallerani, G., Rigaud, M. Mesenchymal Transition: a double-edged sword. Clin Transl Med. 4, 14 (2015).
- Zawadzka, M., et al. CNS-resident glial progenitor/stem cells produce Schwann cells as well as oligodendrocytes during repair of CNS demyelination. Cell Stem Cell. 6, 578-590 (2010).
- Paxinos, G., Ashwell, K. W. S., Törk, I. . Atlas of the developing rat nervous system. , (1994).
- O’Leary, D. D., Chou, S. J., Sahara, S. Area patterning of the mammalian cortex. Neuron. 56, 252-269 (2007).
- O’Leary, D. D., Sahara, S. Genetic regulation of arealization of the neocortex. Curr Opin Neurobiol. 18, 90-100 (2008).
- Sailer, M. H., et al. Non-invasive neural stem cells become invasive in vitro by combined FGF2 and BMP4 signaling. J Cell Sci. 126, 3533-3540 (2013).
- Sailer, M. H., et al. BMP2 and FGF2 cooperate to induce neural-crest-like fates from fetal and adult CNS stem cells. J Cell Sci. 118, 5849-5860 (2005).
- Sailer, M., Oppitz, M., Drews, U. Induction of cellular contractions in the human melanoma cell line SK-mel 28 after muscarinic cholinergic stimulation. Anat Embryol (Berl). 201, 27-37 (2000).
- Wicki, A., Christofori, G. The potential role of podoplanin in tumour invasion. Br J Cancer. 96, 1-5 (2007).
- Wicki, A., et al. Tumor invasion in the absence of epithelial-mesenchymal transition: podoplanin-mediated remodeling of the actin cytoskeleton. Cancer Cell. 9, 261-272 (2006).
- Mishima, K., et al. Increased expression of podoplanin in malignant astrocytic tumors as a novel molecular marker of malignant progression. Acta Neuropathol. 111, 483-488 (2006).
- Motomura, K., et al. Immunohistochemical analysis-based proteomic subclassification of newly diagnosed glioblastomas. Cancer Science. 103, 1871-1879 (2012).
- Kono, T., et al. Immunohistochemical detection of the lymphatic marker podoplanin in diverse types of human cancer cells using a novel antibody. Int J Oncol. 31, 501-508 (2007).
- Raica, M., Cimpean, A. M., Ribatti, D. The role of podoplanin in tumor progression and metastasis. Anticancer Res. 28, 2997-3006 (2008).
- Panchision, D. M., McKay, R. D. The control of neural stem cells by morphogenic signals. Curr Opin Genet Dev. 12, 478-487 (2002).
- Lamouille, S., Xu, J., Derynck, R. Molecular mechanisms of epithelial-mesenchymal transition. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 178-196 (2014).
- Gonzalez-Perez, O., Alvarez-Buylla, A. Oligodendrogenesis in the subventricular zone and the role of epidermal growth factor. Brain Res Rev. 67, 147-156 (2011).
- Hu, J. G., et al. PDGF-AA mediates B104CM-induced oligodendrocyte precursor cell differentiation of embryonic neural stem cells through Erk, PI3K, and p38 signaling. J Mol Neurosci. 46, 644-653 (2012).
- Galvao, R. P., et al. Transformation of quiescent adult oligodendrocyte precursor cells into malignant glioma through a multistep reactivation process. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, E4214-E4223 (2014).
- Liu, C., et al. Mosaic analysis with double markers reveals tumor cell of origin in glioma. Cell. 146, 209-221 (2011).
- Das, S., Srikanth, M., Kessler, J. A. Cancer stem cells and glioma. Nat Clin Pract Neurol. 4, 427-435 (2008).
- Modrek, A. S., Bayin, N. S., Placantonakis, D. G. Brain stem cells as the cell of origin in glioma. World J Stem Cells. 6, 43-52 (2014).
- Sampetrean, O., et al. Invasion precedes tumor mass formation in a malignant brain tumor model of genetically modified neural stem cells. Neoplasia. 13, 784-791 (2011).
- McNeill, R. S., et al. Modeling astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo using cortical astrocytes or neural stem cells from conditional, genetically engineered mice. JoVE. , e51763 (2014).
- Lara-Padilla, E., Caceres-Cortes, J. R. On the nature of the tumor-initiating cell. Curr Stem Cell Res Ther. 7, 26-35 (2012).
- Busch, C., et al. BMP-2-dependent integration of adult mouse subventricular stem cells into the neural crest of chick and quail embryos. J Cell Sci. 119, 4467-4474 (2006).
- Thiery, J. P., Acloque, H., Huang, R. Y., Nieto, M. A. Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease. Cell. 139, 871-890 (2009).
- McDonald, O. G., Wu, H., Timp, W., Doi, A., Feinberg, A. P. Genome-scale epigenetic reprogramming during epithelial-to-mesenchymal transition. Nat Struct Mol Biol. 18, 867-874 (2011).
- Rahimi, R. A., Leof, E. B. TGF-beta signaling: a tale of two responses. J Cell Biochem. 102, 593-608 (2007).
- Xu, J., Lamouille, S., Derynck, R. TGF-beta-induced epithelial to mesenchymal transition. Cell Res. 19, 156-172 (2009).
- Suva, M. L., Riggi, N., Bernstein, B. E. Epigenetic reprogramming in cancer. Science. 339, 1567-1570 (2013).
- Sullivan, R., et al. A possible new focus for stroke treatment – migrating stem cells. Expert Opin Biol Ther. , 1-10 (2015).
