뇌 조각에서 전체 셀 패치 클램프 녹음
Summary
이 프로토콜은 전체 셀 패치 클램프 녹음을 수행하기위한 기본 절차 단계를 설명합니다. 이 기술은 신경 세포의 전기적 동작의 연구를 허용하고, 뇌 조각에서 수행하는 경우, 여전히 상대적으로 잘 보존 된 뇌 회로에 통합되어 신경 세포에서 다양한 신경 기능의 평가를 할 수 있습니다.
Abstract
전체 셀 패치 클램프 기록은 신경 세포의 상당한 부분의 전기적 특성의 조사를 허용하는 전기 생리 기술이다. 이러한 구성에서, 마이크로 피펫은 이전에 사용 된 세포 날카로운 전극 기록 방법보다 더욱 정확한 이온 전류 측정 전류 누설을 방지함으로써 제공 세포막에 밀착된다. 고전적으로, 전체 셀 기록 세포 배양 모델 해리 신경 뇌 조각 뉴런 제제를 포함하는 다양한 형태의 신경 세포에서 수행하고, 그대로 마취 또는 웨이크 동물 일 수있다. 요약하면,이 기술은 대단히 흥분 세포의 수동 및 능동 생물 물리학 적 특성의 이해에 기여하고있다. 이 기술의 주요 장점은 조작 (예, 약물은 실험자 유도 가소성)는 특정한 신경 기능 또는 C를 변경할 수있는 방법의 특정 정보를 제공하는 것이다실시간 hannels. 또한 세포막의 중요한 개구 내부 피펫 용액 자유롭게 도입하는 약물, 예를 들어 작용제 또는 특정 세포 단백질의 길항제를위한 수단을 제공하며 인접 셀의 기능을 변경하지 않고 이러한 대상을 조작하는 세포질 내로 확산 할 수있다. 전체 셀 기록에 초점이 문서는 뇌 조각의 뉴런에 생리 학적으로 관련 맥락에서, 즉 상대적으로 잘 보존 된 뇌 회로에 신경을 기록하는 장점을 가지고 준비를 시행 하였다. 특히, 적절한 약리학과 결합 될 때, 이러한 기술은 학습, 약물 남용에 대한 노출, 스트레스 등의 경험 중 어느 방식에 따른 구체적인 neuroadaptations 발생을 식별 할 수있는 강력한 도구이다. 요약하면, 뇌 조각에서 전체 셀 패치 클램프 녹음은 생체 준비를 오래 지속 변화를 측정 할 수있는 수단을 제공신경 기능에 해당 그대로 깨어 동물에서 개발했습니다.
Introduction
패치 클램프 기술은, 1970 년대 후반에 개발 1,2-되었습니다 전기 생리 기술은 실시간 조직에서 단일 또는 다중 이온 채널의 기능을 연구하기위한 기본 툴이다. 달성 될 수있는 다른 패치 구성 중에서, 전체 셀 패치 클램프 기록은 뉴런의 주요부의 전기적 성질의 조사를 허용한다. 고전적으로,이 기술은 시험 관내에서 두 뇌 조각 갓 해리 뉴런 또는 세포 배양 모델 (3)에 행해진 다. 뇌 조각 뉴런에서 수행하는 경우,이 기술은 여러 가지 장점을 제공한다. 특히, (I) 신경 세포는 다소 상대적으로 보존 된 뇌 회로에 기록되고, 세포 배양 용 제제에 비해 3 생리 관련이있는 환경을 제공한다. 이것은 급성 pharmacolog 임의의 유형에 의해 유발되는 세포 및 분자 사건을 초기에 포착, 또는 실시간으로 모니터링 할 수있게iCal의 조작 – 생체 내 조건의 전형적인 사용하여 달성 될 수없는 시간 해상도; 시각적으로 뇌 조각에 뇌 영역을 식별에 (II) 기능은 모두가 형광 마커를 표현 할 때 뇌 영역은 공부에 대한 특정 신경 세포에 대한 높은 지역 특이성 3 수 있습니다; (ⅲ) (세포 내 레코딩을위한 날카로운 마이크로 피펫으로 막을 천공 대조적으로) 원형질막의 상당 부분을 열어 세포의 세포 내 공간에 접근 4. 차례로,이 내부 용액을 구성하는 특정 이온의 함량 또는 농도가 너무 분자 표적을 수정할 또는 셀룰러 메커니즘이 상이한 조건 하에서 조사 될 수 있습니다. 예를 들어, 전체 셀 구성, 특정 약학 제 (예 : 길항제) 설정시 한 기록 마이크로 피펫 (패치 피펫) 용액에 직접 세포질 내로 확산 및 putat에 역할을 추가 할 수 있다는이웃하는 셀들에 상기 타겟의 기능을 변경하지 않고 세포 내 표적 필자. 또한, 마이크로 피펫 날카로운 기록 비교 패치 클램프 전극의 선단에 큰 개구 낮은 저항, 낮은 경쟁중인 잡음 및 셀 (4)의 내부로 더 따라서 전기적 접속을 제공한다. 그러나, 피펫 팁에 큰 구멍이 셀 투석으로 이어질 및 연구 5,6에서있는 생명 현상의 발현에 중요 할 수있다 세포 내 분자 기계함으로써 손실 할 수 있습니다. 이 경우, 날카로운 전극 녹음이 더 적합 할 수있다. 녹음이 유형시켜 세포 내 공간과 내부 피펫 용액의 이온 교환을 최대한 방지 전체 셀 녹음에 사용되는 것보다 훨씬 작은 기공을 가진 마이크로 피펫을 필요로한다.
(급성 또는 만성) 경험의 모든 형태를 포함 남용 11,1의 약물에 노출 7-10 학습2 등 응력 13,14은 특정 뇌 영역에서의 신경 기능의 다양한 측면을 변경할 수있다. 이러한 변화는 종종 (일 시간)을 개발하기 위해 시간을 필요로하기 때문에, 특정 경험을받은 동물의 뇌 조각에서 전체 셀 녹음 연구자들은 이러한 변화를 식별 할 수 있습니다. 기본적으로 (모든 경우) 신경 세포의 기능 (예를 들면, 리간드 – 활성화 된 이온 채널 전압 관문 이온 채널, 신경 전달 물질 트랜스 포터)함으로써 뇌 회로 활동 및 동작 환경에 의해 변경 될 수있다 (환경 의존성 참여 요소 많은 소성) 10,15-17. 신경 수준에서 뇌 회로의 활동이 시냅스 사이의 지속적인 상호 작용 (예를 들면, 글루타메이트 전송) 및 고유 세포의 흥분 요인 (예를 들어, axosomato-수지상 이온 채널에서 나온다 : 칼륨, K +, 나트륨, 나트륨 + 칼슘, 칼슘 2 + ). 도 ë을 사용하여 특정 조건에서전자 셀 패치 클램프 전기 생리학 기술, 시냅스 대 고유 흥분의 변화에서 특히 발생하는 신호 변경은 분리 될 수있다.
대부분의 경우, 시냅스 흥분성 전체 셀 전압 – 클램프 기술을 이용하여 평가된다. 본 촬영 모드는 α 아미노 -3- 히드 록시 -5- 메틸 -4- isoxazolepropionic 산 수용체에 의해 매개되는 예를 들어, 이온 전류 [의 측정 (허용 AMPA 수용체)와 신경 세포막을 통한 N 메틸 -D- 아스파르트 산 수용체 (NMDA 수용체)] 세트 전압의 막전위 채. 여기에서, 실험자는 세슘을 포함하는 내부 마이크로 피펫 솔루션 (고사 +), K + 채널의 폭 넓은 차단제 (키 고유 흥분 요인)를 사용합니다. 전체 셀 구성의 확립되면, 세포 내 공간에서 고사 +의 확산은 K + 채널을 차단하고, 이에 상대적으로 효율적인 공간 클램프 및 사전을 모두 허용다른 측정치들에 내재 흥분성 요인의 영향 벤트. 불규칙한 모양의 세포 (예를 들어, 신경 세포), 그리고 18, 19 아버 광대하고 복잡한 수지상 특히 신경을 녹음 할 때 공간 클램프의 문제, 즉, 전압 클램프에 어려움 전체 셀은 발생한다. 체세포 전압 클램프 저조한 제어 뉴런의 수지상 트리 전압 때문에, 연구중인 수지상 전기 신호의 다양한 양태는 수지상의 거리에 비례하여 변형된다. (인공 뇌 – 척수액, ACSF) 세포 외 용액에 용해 된 이러한 피크로 톡신 (감마 – 아미노 산, GABA 수용체 길항제) 또는 kynurenic 산 (글루타메이트 수용체의 광범위한 차단제)와 같은 약물 학적 도구와 결합하여,이 기술은 글루타메이트를 측정 할 수 있도록 수용체 -와 GABA 각기 전류를 R은 중재.
대조적으로, 극한의 흥분은 일반적으로 전류 – 클램프 기록 모드에서 평가된다.전압 클램프 기록 반대로, 본 촬영 모드는 신경 세포막에 흐르는 이온 전류에 의한 막 전위의 변화를 측정 할 수있다. 뉴런 나 +와 K + 채널 모두를 필요로 활동 전위를 생성하기 위해 일반적으로 고유 흥분의 변화는 능력의 변화를 통해 평가된다. 현재 클램프 녹음을 수행 할 때 따라서, 가능한 Micropipette는 K + 대신 고사 +를 포함하는 내부 용액으로 채워집니다. 글루타메이트와 GABA에게 ACSF에 용해 된 수용체 매개 전류 차단되는 약물과 결합하여,이 실험 설계 시냅스 흥분성의 전위 변화에 의해 오염되지 않고 신경 소성 본질적인 요인 (예를 들면, K는 + 채널)의 기여를 측정 할 수 있도록 요인.
이 문서에서는 t 기본 필요한 절차 단계를 설명합니다O (I) 건강한 뇌 조각을 제조; (ⅱ) 전체 셀 구성을 달성하고, (ⅲ) 극한 흥분성 시냅스 및 평가하는 기본 파라미터를 모니터링한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 뇌 조각의 뉴런에서 전체 셀 패치 클램프 실험을 수행하기위한 기본 절차를 설명합니다. 그러나,이 기술의 복잡성 전위 감도 완전이 문서에서 설명 될 수 없다. 여기, 우리는 가장 기본적인 단계를 묘사하고 성공적이고 엄격한 전체 세포 녹음을 달성하기위한 제어해야합니다 중요한 매개 변수를 강조하기 위해 노력했다. 더 이론적 인 학습, 많은 책과 기사는 뇌 조각 3,21-24과</su…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 UT 사우스 웨스턴 시작 기금 (SK)에 의해 지원되었다.
Materials
| Isolated pulse stimulus generator | A.M.P.I | Master-8 | |
| Isolation unit (ISO-Flex) | A.M.P.I | ISO-Flex | |
| Computer controlled Amplifier | Molecular Devices | Multiclamp 700B | |
| Digital Acquisition system | Molecular Devices | Digidata 1500 | |
| Microscope | Olympus | BX-51 | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-200 | |
| Chamber and in-line Heater | Warner Instruments | TC-344B | |
| Vibratome Slicer | Leica | VT1000 S | |
| Micropipette Puller | Narishige | PC-10 | |
| Imaging Camera | Q Imaging | QIClick-F-M-12 | |
| Narishige pipette puller PC-10 | Narishige | PC-10 | |
| Glass capillaries | WPI | TW150F-3 | |
| Slice hold-down (harp) | Warner Instruments | 64-0255 | |
| Slice Chamber | Warner Instruments | RC-26 | |
| Nonmetallic syringe needle | World Precision Instruments | MF28G67-5 | |
| Syringe filters | Nalgene | 176-0045 | |
| Glue Gun | Home Depot | various | |
| Gas dispersion tube | Ace Glass Inc. | various | |
| Decapitation scissors | Home Depot | 100649198 | |
| Scalpel Handle #3 | World Precision Instruments | 500236 | |
| Small straight sharp tips scissors | World Precision Instruments | 14218 | |
| Vessel canulation forceps | World Precision Instruments | 500453 | |
| Curved hemostatic forceps | World Precision Instruments | 501288 | |
| Economy Tweezers #3 | World Precision Instruments | 501976-6 | |
| Spatula | Fisher Scientific | 14357Q | |
| Scooping spatula | Fisher Scientific | 14-357Q | |
| Petri dish | Fisher Scientific | 08-747B | |
| Filter paper | Lab Depot | CFP1-110 | |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions | |||
| Cs-Gluconate internal solution (pH 7.2–7.3, 280–290 mOsm) | |||
| D-gluconic acid 50% | Sigma Aldrich/various | G1951 | |
| Cesium-OH (CsOH) 50% | Sigma Aldrich/various | 232041 | |
| NaCl, 2.8 mM | Sigma Aldrich/various | S7653 | |
| HEPES, 20 mM | Sigma Aldrich/various | H3375 | |
| EGTA, 0.4 mM | Sigma Aldrich/various | E4378 | |
| tetraethylammonium-Cl, 5 mM | Sigma Aldrich/various | T2265 | |
| Na2GTP, 0.3 mM | Sigma Aldrich/various | G8877 | |
| MgATP, 2 mM | Sigma Aldrich/various | A9187 | |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| K-Gluconate internal solution (pH 7.2–7.3, 280–290 mOsm) | |||
| K D-gluconate, 120 mM | Sigma Aldrich/various | G4500 | |
| KCl, 20 mM | Sigma Aldrich/various | P3911 | |
| HEPES, 10 mM | Sigma Aldrich/various | H3375 | |
| EGTA, 0.2 mM | Sigma Aldrich/various | E4378 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich/various | M8266 | |
| Na2GTP, 0.3 mM | Sigma Aldrich/various | G8877 | |
| MgATP, 2 mM | Sigma Aldrich/various | A9187 | |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| Standard artificial cerebrospinal fluid (ACSF, osmolarity ≈ 300-310 mOsm) | |||
| KCl, 2.5 mM | Sigma Aldrich/various | P3911 | |
| NaCl, 119 mM | Sigma Aldrich/various | S7653 | |
| NaH2PO4-H20, 1 mM | Sigma Aldrich/various | S9638 | |
| NaHCO3, 26.2 mM | Sigma Aldrich/various | S8875 | |
| Glucose, 11 mM | Sigma Aldrich/various | G8270 | |
| MgSO4-7H2O, 1.3 mM | Sigma Aldrich/various | 230391 | |
| CaCl2-2H20, 2.5 mM | Sigma Aldrich/various | C3881 | |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| Additional compounds used for solutions preparation | |||
| KOH | various | ||
| Kynurenic acid | Sigma Aldrich/various | K3375 | |
Riferimenti
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