Gli xenotrapianti di glioblastoma multiforme derivati da pazienti possono essere miniaturizzati in microtumori viventi utilizzando il sistema di coltura di biogel umano 3D. Questo test tumorale 3D in vivo è adatto per i test di risposta ai farmaci e la profilazione molecolare, compresa l'analisi cinematica.
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Articolo metodologico
Generazione di Microtumors Uso 3D Biogel Umano Sistema Cultura e cellule di glioblastoma paziente-derivato per Kinomic Profiling and Drug Testing risposta
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'uso di xenotrapianti derivati da pazienti per modellare i tumori ha fornito importanti informazioni sulla biologia del cancro e sulla risposta ai farmaci. Tuttavia, richiedono tempo, sono costosi e richiedono molta manodopera. Per superare questi ostacoli, molti gruppi di ricerca si sono rivolti a colture sferoidi di cellule tumorali. Sebbene utili, gli sferoidi tumorali o gli aggregati non replicano le interazioni cellula-matrice come si trovano in vivo. Pertanto, gli approcci di coltura tridimensionale (3D) che utilizzano un'impalcatura di matrice extracellulare forniscono un sistema di modello più realistico per l'indagine. A partire da xenotrapianti sottocutanei o intracranici, il tessuto tumorale viene dissociato in una sospensione a singola cellula simile alle neurosfere delle cellule staminali tumorali. Queste cellule vengono poi incorporate in una matrice extracellulare di derivazione umana, il biogel umano 3D, per generare un gran numero di microtumori. È interessante notare che i microtumori possono essere coltivati per circa un mese con un'elevata vitalità e possono essere utilizzati per test di risposta ai farmaci utilizzando saggi standard di citotossicità come il 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromuro (MTT) e l'imaging di cellule vive utilizzando Calcein-AM. Inoltre, possono essere analizzati tramite immunoistochimica o raccolti per la profilazione molecolare, come la profilazione cinematica ad alto rendimento basata su array, che è descritta anche qui. I microtumori 3D, quindi, rappresentano un sistema di modelli versatile ad alto rendimento in grado di replicare più da vicino la biologia dei tumori in vivo rispetto agli approcci tradizionali.
Introduzione
I intracraniche tumori cerebrali maligni primitivi più comuni sono grado astrocitomi III e IV grado glioblastoma multiforme (glioblastoma o GBM). Questi tumori offrono prognosi poveri con mediana di sopravvivenza di un anno tra i 12 - 15 mesi con le terapie correnti per GBM negli Stati Uniti 1-3. terapie multimodalità comprendono la chirurgia, radioterapia e chemioterapia compresa temozolomide (TMZ) e gli agenti chinasi mirati. segnalazione della chinasi è spesso dysregulated in GBM, tra sottogruppi di tumori con amplificazione o mutazioni attivanti nel Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR), aumenti di Platelet Derived Growth Factor Receptor (PD....
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Protocollo
NOTA: tutte le valutazioni di terapia xenotrapianto sono state effettuate utilizzando un modello di tumore ortotopico per glioblastoma su un protocollo approvato dal Comitato Istituzionale cura e l'uso di animali.
1. Isolamento di cellule GBM xenotrapianto paziente-derivati
- Preparazione dei reagenti
- Re-costituiscono collagenasi-I in acqua sterile ad una concentrazione di 5 mg / ml filtro e sterile. Conservare in 1 ml aliquote a -20 ° C (concentrazione finale è di 50 mg / ml in 100 ml di soluzione enzimatica).
- Sciogliere 100 mg fattore di crescita epidermico (EGF) in 2 ml sterile fosfato-B....
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Risultati
Abbiamo dimostrato che il sistema cultura Biogel 3D supporta la crescita a lungo termine e la funzione di molteplici tipi di cellule. In questo progetto di collaborazione, xenolines GBM pazienti-derivato (PDX) vengono utilizzati per la produzione di centinaia di microtumors. Cellule dissociate (3 x 10 5) o neurospheres (40 - 50) sono stati incorporati in perline Biogel (2 mm) e dopo gelificazione pratica sono coltivate in un bioreattore personalizzata NB-media riempito. vitali.......
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Discussione
Passaggi critici all'interno del protocollo prevalentemente riguardano microtumor generazione, nonché il dosaggio del farmaco e manutenzione. Poiché le perle microtumor sono fragili e facilmente strappata, estrema cura è necessaria in entrambe le fasi di sviluppo di un test e manutenzione. Se si verifica un errore durante uno di questi processi, l'interpretazione sperimentale può essere compromessa, provocando l'estensione o inutili ripetizioni di esperimenti o addirittura l'esclusione dei dati.
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Dichiarazioni
R.S. e R.S.S. sono dipendenti di Vivo Biosciences. J.C.A. è parzialmente finanziato dal Kinome Core dell'UAB.
Ringraziamenti
Supportato da NIH R21 concessione (PI: C. Willey, CA185712-01), Cervello premio tumore SPORE (PD: GY Gillespie, P20CA 151.129-03) e il contratto SBIR (PI: R. Singh, N43CO-2.013-00.026).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Collagenasi-I | Sigma-Aldrich | CO130 | |
| Tripsina EDTA (10x) | Invitrogen | 15400-054 | |
| Neurobasal-A | Life Technologies | 10888-022 | |
| N-2 Integratore | Life Technologies | 17502-048 | 1x concentrazione finale |
| B-27 Integratore senza vitamina A | Life Technologies | 12587-010 | 1x concentrazione finale |
| FGF-basic Life Technologies umano ricombinante | PHG0266 | concentrazione | |
| finale 10 ng/mlEGF umano ricombinante | Life Technologies | PGH0315 | concentrazione finale 10 ng/ml |
| L-Glutammina | Corning Cellgro Mediatech | 25-005-CI | 2 mM concentrazione finale |
| Fungizone | Omega Scientific | FG-70 | 2.5 &; g/ml |
| concentrazione finale Penicillina Streptomicina | Omega Scientific | PS-20 | 100 U/ml Penicillina G, 100 µ g/ml Concentrazione finale di streptomicina |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | 50 ng/ml concentrazione finale |
| MTT | Life Technologies | M6494 | preparato a 5 mg/ml in PBS e filtrato in modo sterile, 1 mg/ml in pozzetto |
| SDS | Fisher | BP166 | per tampone di lisi MTT, preparato al 10% in 0,01 M HCl, 5% nel pozzo |
| HCl | Fisher | A144SI-212 | per tampone di lisi MTT, preparato a 0,01 M con SDS, 5 mM in pozzetto |
| Calcein AM | Life Technologies | C1430 | 1 mM in DMSO stock, 2 µ M in soluzione colorante PBS, 1 µ M in pozzo |
| Halt' s Cocktail di inibitori della fosfatasi proteica | Pierce ThermoScientific | 78420 | Rapporto 1:100 in MPER |
| Inibitore della proteasi proteica di Halt | Pierce ThermoScientific | 87786 | Rapporto 1:100 in |
| MPER Reagente per l'estrazione di proteine di mammifero (MPER) | Pierce ThermoScientific | PI78501 | |
| Trypan Blue | Pierce ThermoScientific | 15250-061 | |
| DMSO | Fisher | BP231 | per la dissoluzione di calceina AM e composti |
| Soluzione salina tamponata con fosfato senza Ca/Mg | Lonza | 17-517Q | diluito a 1x con acqua ultrapura MiliQ e filtrato sterile (per colture cellulari) |
| Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco con Ca/Mg | Corning Cellgro Mediatech | 20-030-CV | diluita a 1x con acqua ultrapura MiliQ (per lavaggio pre-fissaggio) |
| Formalina tamponata neutra al 10% | Protocollo | 032-060 | |
| Trypan Blue | Pierce ThermoScientific | 15250-061 | |
| Inibitore | Vivo Biosciences | HDHG-5 | |
| Pierce | 78420 | ||
| Inibitore della proteasi proteica di Halt | Pierce | 87786 | |
| Reagente per l'estrazione di proteine dei mammiferi (MPER) | Thermo Scientific | 78501 | |
| Chip di profilazione array di proteina tirosina chinasi (PTK) | PamGene | 86312 | |
| tampone PTK chinasi | PamGene | 36000 | 300 µ l 10x PK buffer stock in 2,7 ml dH2O, numero di catalogo per il kit di reagenti PTK |
| ATP | PamGene | 36000 | numero di catalogo per il kit di reagenti PTK |
| PY20- Anticorpo coniugato FITC | PamGene | 36000 | numero di catalogo per il kit di reagenti |
| PTK Additivo PTK | PamGene | 32114 | |
| Provetta PTK-MM1 (10x BSA) | PamGene | 36000 | numero di catalogo per il kit |
| di reagenti PTKChip di profilazione array serina/treonina chinasi (STK) | PamGene | 87102 | |
| tampone chinasi STK | PamGene | 32205 | numero di catalogo per il kit di reagenti STK |
| Miscela di anticorpi primari STK (provetta DMAB) | PamGene | 32205 | per il kit di reagenti STK |
| Anticorpo secondario coniugato FITC | PamGene | 32203 | |
| STK-MM1 (100x BSA) | PamGene | 32205 | numero di catalogo per il kit di reagenti STK |
| STK Antibody Buffer | PamGene | 32205 | numero di catalogo per il kit di reagenti STK |
| Equipment | |||
| #11 Lame, sterili | Fisher | 3120030 | |
| #3 manici di bisturi, sterili | Fisher | 08-913-5 | |
| Piastre di Petri in vetro da 100 mm | Fisher | 08-748D | |
| Pinze semicurve | Fisher | 12-460-318 | |
| Pallone di tripsinizzazione | Fisher | 10-042-12B | |
| Agitatore magnetico | Fisher | 14-490-200 | |
| 3/4" ancorette | Fisher | 14-512-125 | |
| B-D colino cellulare | Fisher | #352340 | |
| B-D 50 ml Provetta da centrifuga | Fisher | #352098 | |
| PamStation 12 | PamGene | ||
| BioNavigator 6.0 software di analisi kinomica | PamGene | ||
| Evolve Software | PamGene | ||
| UpKin (previsione delle chinasi a monte) | PamGene | ||
| gentleDissociatore MACS | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Sistema di coltura cellulare rotante (RCCS) | Synthecon | RCCS-D | con HARV monouso da 10 ml |
Riferimenti
- Ohgaki, H., Kleihues, P. Population-based studies on incidence, survival rates, and genetic alterations in astrocytic and oligodendroglial gliomas. J Neuropathol Exp Neurol. 64 (6), 479-489 (2005).
- Wen, P. Y., Kesari, S. Malignant gliomas in adults.....
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Ristampe e permessi
