El aislamiento y la generación de perfiles de exosomas de la bilis humana que contiene microRNA
Summary
Bile fluid is a valuable source of extracellular vesicles/exosomes that contain potentially important biomarkers. This protocol represents a robust method to isolate exosomes from human bile for further analyses including miRNA profiling.
Abstract
exosome la investigación en los últimos tres años ha ampliado considerablemente el alcance hacia la identificación y caracterización de biomarcadores y sus usos terapéuticos.
Los exosomas han sido recientemente demostrado que contienen microRNAs (MIR). MIRS mismos han surgido como biomarcadores valiosos para fines de diagnóstico. Como la recogida de muestras en clínicas y hospitales es bastante variable, miARN aislamiento de la bilis toda varía sustancialmente. Para lograr perfiles de miARN robustos, precisos y reproducibles de muestras de bilis recogidos de una manera sencilla requerido el desarrollo de un protocolo de alta calidad para aislar y caracterizar los exosomas de la bilis. El método requiere varias centrifugaciones y una etapa de filtración con una etapa de ultracentrifugación final para sedimentar las exosomas aisladas. La microscopía electrónica, transferencias Western, citometría de flujo y análisis óptico de nanopartículas de múltiples parámetros, si están disponibles, son pasos cruciales para validar la caracterización de la calidad del correoxosomes. Para el aislamiento de los genes miARN de estos exosomas, Rematar el lisado con una, miRNA sintético no específica de una especie como Caenorhabditis elegans, es decir, Cel-miR-39, es importante para la normalización de la eficacia de la extracción de ARN. El aislamiento de exosomas del líquido biliar siguiendo este método permite que el éxito miARN perfiles de las muestras de bilis acumulada durante varios años a -80 ° C.
Introduction
Al igual que otros fluidos biológicos, es decir, la leche materna, plasma u orina, bilis contiene lípidos exosomas, vesículas ricas 1-4. Los exosomas pueden inducir o alterar las funciones biológicas en células receptoras 5, 6, una forma de comunicación célula-célula que podría ser parte de su función normal 4, 7-9. Los exosomas pueden contener especies miARN que pueden proporcionar una valiosa fuente de biomarcadores para el diagnóstico 10. perfiles de miRNAs han ganado considerable atención en los últimos años como marcadores de diagnóstico y pronóstico para una variedad de enfermedades 11-14.
sí miARN puede encontrarse en fluidos biológicos, posiblemente liberada por las células muertas y la cantidad de células que se desprenden pueden ser influenciados en gran medida por una enfermedad subyacente. El perfil de miARN de exosomas no refleja necesariamente el perfil de miRNA de las células originarias 6, 10, 15-17, sin embargo, puede llevar a exosomas firmas de miARN que podrían ser característico de la CE de los padreste gusta una célula tumoral. Exosomas derivado de un tumor se han identificado en el plasma de pacientes con adenocarcinoma de pulmón, cáncer de próstata y otros tumores 8, 16, 18.
El objetivo de este método es el aislamiento fiable y robusto de exosomas de muestras biliares humanos, en gran parte independientes de sus procedimientos de manipulación anteriores. Fue desarrollado para utilizar bilis como una fuente fiable de miARN para el diagnóstico potencial de las enfermedades de las vías biliares tales como colangiocarcinoma 19. Consta de varias etapas de centrifugación con el aumento de las velocidades de aislar exosomas y podría ser aplicable a otros fluidos biológicos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Para utilizar de forma fiable exosomas aisladas de la bilis, es importante emplear los métodos de aislamiento de alta calidad consistentes para obtener muestras de alta calidad a cambio. La metodología definida en este trabajo es una manera bien establecida para aislar los exosomas y miARN de la bilis humana. En él se destacan varios pasos cruciales en la caracterización de los exosomas aisladas que como mínimo deberían formar parte de microscopía electrónica de análisis óptico o de nanopartículas y transfere…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported by a K08 Award (DK090154-01) from the National Institutes of Health (NIH; to F.M.S.).
Materials
| 0.2µm Polyethersulfone (PES) membrane filter | Corning | 431229 | |
| thinwall polyallomer ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 331374 | |
| SW40Ti rotor | Beckman Coulter | ||
| LM10-HS | Nanosight | ||
| Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) software | Nanosight | ||
| mirVANA | Life Technologies | AM1560 | |
| cOmplete Protease Inhibitor | Roche distributed by Sigma-Aldrich | 4693116001 | |
| Immobilon PSQ | Millipore, Bedford MA | ISEQ00010 | |
| Anti-CD63 antibody | Abcam | ab59479 | |
| Anti-Tsg101 | Abcam | ab30871 |
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