Isolering och profilering av MicroRNA innehåller exosomes från Human Bile

Summary

Bile fluid is a valuable source of extracellular vesicles/exosomes that contain potentially important biomarkers. This protocol represents a robust method to isolate exosomes from human bile for further analyses including miRNA profiling.

Abstract

Exosome forskning under de senaste tre åren har betydligt längre räckvidd mot identifiering och karakterisering av biomarkörer och deras terapeutiska användningar.

Exosomer har nyligen visats innehålla mikroRNA (MIRS). Mirs själva har uppstått som värdefulla biomarkörer för diagnostiska ändamål. Som provtagning på kliniker och sjukhus är ganska varierande, miRNA isolering från hela galla varierar kraftigt. För att uppnå robusta, noggranna och reproducerbara miRNA profiler från insamlade galla prover på ett enkelt sätt krävs utveckling av en hög kvalitetsprotokoll för att isolera och karakterisera exosomes från galla. Metoden kräver flera centrifuge och ett filtreringssteg med en slutlig ultracentrifugering steg för att pelletera isolerade exosomes. Elektronmikroskopi, Western blöts, flödescytometri och flera parametrar nanopartiklar optisk analys, där sådana finns, är avgörande karakteriserings åtgärder för att verifiera kvaliteten på exosomes. För isoleringen av miRNA från dessa exosomer, spiking lysatet med en icke-specifik, syntetisk miRNA från en art som Caenorhabditis elegans, dvs, Cel-miR-39, är viktigt för normalisering av RNA extraktionseffektivitet. Isoleringen av Exosome från galla vätska följer denna metod gör det möjligt för framgångsrika miRNA profilering från galla prov lagrade under flera år vid -80 ° C.

Introduction

Liksom andra biologiska vätskor, dvs bröstmjölk, plasma eller urin, innehåller galla exosomes, fettrika blåsor ^1-4. Exosomes kan inducera eller ändra biologiska funktioner i mottagarceller ^{5, 6,} en form av cell-cell kommunikation som kan vara en del av deras normala funktion ^{4, 7-9.} Exosomes kan innehålla miRNA arter som kan ge en värdefull källa av biomarkörer för diagnos ^10. miRNA profiler har fått avsevärd uppmärksamhet under senare år som diagnostiska och prognostiska markörer för en mängd olika sjukdomar ^11-14.

miRNA själv finns i biologiska vätskor, eventuellt frigörs av döda celler och mängden skjul celler kan i hög grad påverkas av en underliggande sjukdom. Mirna profilen exosomes inte nödvändigtvis återspeglar den miRNA profil cell ursprung ^{6, 10, 15-17,} men exosomes kan bära miRNA signaturer som kan vara kännetecknande för föräldra cell som en tumörcell. Tumörhärrörande exosomer har identifierats i plasma hos patienter med lungadenokarcinom, prostatacancer och andra tumörer ^{8, 16, 18.}

Målet med denna metod är tillförlitlig och robust isolering av exosomes från mänskliga galla exemplar, i stort sett oberoende av deras tidigare hanteringsprocedurer. Den utvecklades för att utnyttja galla som en pålitlig källa för miRNA för den potentiella diagnostik av sjukdomar i gallgången såsom kolangiokarcinom ^19. Det består av flera steg av centrifugering med ökande hastigheter för att isolera exosomes och skulle kunna tillämpas på andra biologiska vätskor.

Protocol

Erhålla galla från patienter med endoskopisk retrograd kolangiopankreatografi (ERCP) kräver godkännande av en mänsklig försöksstudieprotokoll av Institutional Review Board. Allt arbete som presenteras här godkändes av Johns Hopkins University Institutional Review Board. 1. Exosome Isolering från Bile Utför endoskopisk retrograd kolangiopankreatografi (ERCP). Placera patienten i ryggläge och intuberas. Passera en duodenoscope genom patientens mun och sätt in d…

Representative Results

Eftersom exosomer är för små för att detekteras genom regelbunden mikroskopi eller flödescytometri, har elektronmikroskopi eller nanopartikel optisk analys som skall utföras. Nanopartikel optisk analys har den fördelen framför elektronmikroskopi att det också är kvantitativ och ger storleksfördelning och koncentration. Instrumentet införs en fint fokuserad laserstråle genom ett glasprisma in i provet. Den Brownsk rörelse av de isolerade blåsor fångas via en EMCCD hög kä…

Discussion

För att på ett tillförlitligt sätt utnyttja exosomer isolerade från galla, är det viktigt att använda en jämn och hög kvalitet isolering metoder för att få hög kvalitet prover i gengäld. Den metod som anges i detta dokument är ett väletablerat sätt att isolera exosomes och miRNA från human galla. Det belyser flera viktiga steg i karakteriseringen av de isolerade exosomes som åtminstone bör innehålla elektronmikroskopi eller nanopartiklar optisk analys och Western blöts.

…

Materials

0.2µm Polyethersulfone (PES) membrane filter	Corning	431229
thinwall polyallomer ultracentrifuge tubes	Beckman Coulter	331374
SW40Ti rotor	Beckman Coulter
LM10-HS	Nanosight
Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) software	Nanosight
mirVANA	Life Technologies	AM1560
cOmplete Protease Inhibitor	Roche distributed by Sigma-Aldrich	4693116001
Immobilon PSQ	Millipore, Bedford MA	ISEQ00010
Anti-CD63 antibody	Abcam	ab59479
Anti-Tsg101	Abcam	ab30871