Ekspression og oprensning af viruslignende partikler til vaccination
Summary
Her præsenterer vi en protokol til at syntetisere viruslignende partikler ved hjælp af enten baculovirus eller pattedyrekspressionssystemer og ultracentrifugering rensning. Denne meget tilpasselig tilgang bruges til at identificere virale antigener som vaccine mål på en sikker og fleksibel måde.
Abstract
Virus-lignende partikler (VLP'er) og subvirale partikler (SVPs) er en alternativ tilgang til viral vaccine design, der giver fordelene ved øget biosikkerhed og stabilitet i forhold anvendelse af levende patogener. Ikke-infektiøse og selv-samling, der VLP bruges til at præsentere strukturelle proteiner som immunogener, uden om behovet for levende patogener eller rekombinante virale vektorer til antigen levering. I denne artikel viser vi de forskellige stadier af VLP design og udvikling til fremtidige applikationer i præklinisk dyreforsøg. Proceduren omfatter følgende faser: udvælgelse af antigen, ekspressionen af antigen i cellelinje af valg, rensning af VLP / SVPs, og kvantificering for antigen dosering. Vi demonstrerer anvendelse af både pattedyr- og insektcellelinier til ekspression af vores antigener og vise, hvordan metoder adskiller sig i udbytte. Metoden præsenteres kan gælde for en række patogener og kan opnås ved at erstatte de antigener med immunogen structural proteiner af brugerens mikroorganisme af interesse. VLP'er og SVPs hjælpe med antigen karakterisering og udvælgelse af de bedste vaccinekandidater.
Introduction
Viruslignende partikler (VLP'er) er en godkendt teknologi til vaccination af mennesker. Faktisk er nogle af de mere contemporarily licenserede vacciner, herunder det humane papillomavirus (HPV) og hepatitis Β (HepΒ) vacciner anvender denne fremgangsmåde. VLP'er er dannet af strukturelle proteiner stand til selv-samling. De samlede partikler efterligne virale morfologier, men kan ikke inficere eller replikere fordi de mangler virale genomer. VLP'er kan udtrykkes og oprenses fra en række prokaryote og eukaryote systemer. En gennemgang af litteraturen viste, at forskellige ekspressionssystemer er ansat på følgende satser: bakterier – 28%, gær – 20%, plante – 9%, insekt – 28%, og pattedyr – 15% 1. Af note, er HPV-vacciner baseret på L1-capsidprotein produceret i gær (Gardasil) eller i en insektcelle-system (Cervarix) 2. HepΒ vacciner, Recombivax og Engerix-Β, fremstilles også i gær, og er sammensat af HepΒ overfladeantigen 34.
Vi anvender pattedyr og insekter-ekspressionssystemer til frembringelse af VLP'er der kræver co-ekspression af multiple strukturelle proteiner til samling. Vores arbejde fokuserer på at designe, producere, og rensningsprocesser VLP-baserede vacciner mod humane patogener: influenzavirus, respiratorisk syncytialvirus (RSV), dengue virus (DENV), og chikungunya virus (CHIKV). Vores metoder er fleksible nok til at muliggøre co-ekspression af de multiple strukturelle proteiner fra flere ekspressionsplasmider, eller et enkelt ekspressionsplasmid (figur 1). Vi har tidligere fremstillet og oprenset H5N1 VLP'er samlet af co-ekspression af plasmider, der koder influenza hemagglutinin (HA), neuraminidase (NA) og matrix (M1) i humane embryonale nyre 293T-celler 5,6. Generne blev kodon-optimeret til ekspression i mammale celler og klonet ind pTR600, en eukaryot ekspressionsvektor indeholdende cytomegalovirus immediate-early-promotor plus intron A til initiering transcription af eukaryote indsatser og bovint væksthormon polyadenyleringssignalet for terminering af transskription 7. En lignende fremgangsmåde under anvendelse af tre-plasmid co-ekspression af HA, NA (figur 1A) og et alternativt viral matrix protein, HIV Gag p55, blev anvendt til generering af sæsoninfluenza subtype human H3N2 VLP'er i denne undersøgelse og er blevet vist at frembringe VLP'er af lignende størrelse som influenza partikler 8. Selvom influenzavacciner overvejende fremkalder anti-HA-antistoffer, tilsætning af influenza-neuraminidase medierer sialidase aktivitet at aktivere VLP spirende fra transficerede celler 9 og også præsentere yderligere immunogene mål. For at producere RSV VLP'er, vi valgte også den uafhængige kerne af HIV Gag at designe prototypiske vacciner, der præsenterer udelukkende RSV overfladeglycoproteiner for yderligere at vise fleksibilitet VLP-dannelse ved hjælp af HIV Gag, som tidligere beskrevet og karakteriseret ved elektronmikroskopi 6,10. Andrehar tidligere vist, at VLP'er præsenterer RSV-glycoproteiner kan samles ved anvendelse af forskellige virale komponenter fra Newcastle Disease-virus (NDV) 11, og influenza-matrix 12. Fuld længde overfladeglycoprotein sekvenser blev brugt i dette studie at fastholde native konformationer, som kan være nødvendige for funktionel receptorbinding og antistofgenkendelse assay gennem enzymkoblet immunosorbentassay (ELISA).
Vores eksempler på brug af enkelte plasmid ekspressionssystemer til at generere partikler er DENV og CHIKV. I tilfælde af DENV, kan vi producere subvirale partikler (SVPs) uden capsid i 293T-celler fra et enkelt plasmid indeholdende et PRM / E strukturelle gen ekspressionskassetten 13. Udtrykket SVP anvendes til at betegne den manglende en kerne eller capsidprotein ved samling af virale strukturelle proteiner. Chik VLP'er kan også fremstilles under anvendelse af et enkelt plasmid indeholdende nogle CHIKV strukturelle gen kassette, der koder for capsid og kappeproteiner, eller i insect celler ved infektion med et rekombinant baculovirus der koder for det samme strukturelle gen kassette optimeret til insektcelleekspression (figur 1B – C).
Slutresultatet af udtrykket tilgange beskrevet ovenfor er frigivelsen af VLP'er i celledyrkningsmedium, som derefter kan oprenses via ultracentrifugering gennem en 20% glycerolpude. I denne rapport præsenterer vi metoder til at udtrykke og rense disse VLP'er fra pattedyr og insektcellesystemer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi har anvendt de ovenfor beskrevne teknikker med succes udtrykke og oprense SVPs og VLP'er sammensat af flere strukturelle proteiner til forskellige patogener. Generelt anvender vi pattedyrekspressionssystemer at generere vores VLP'er. i vores hænder, mammal-celleafledt imidlertid Chik VLP udbytter var lave. Chik VLP udbytte var mere robust, når du bruger et rekombinant baculovirus-insekt celle system. Generelt baculovirus-insektcellesystemer giver højere mængder af rekombinante proteiner, som kan skyldes d…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi ønsker at anerkende de forudgående medlemmer af Ross lab, der har hjulpet optimere protokollen for maksimal effektivitet og udbytter.
Materials
| Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12163 | |
| DMEM | Cellgro | 10-013 | |
| Lipofectamine | Life Technologies | L3000075 | Lipofectamine 2000, Lipofectamine 3000 |
| Opti-MEM I | Life Technologies | 31985062 | |
| Bac-to-Bac Baculovirus Expression System | Life Technologies | 10359-016 | |
| Cimarec I 6 multipoint stirrer plate | ThermoFisher Scientific | 50094596 | |
| Polyclear ultracentrifuge tubes | Seton | 7025 | Confirm appropriate tubes for ultracentrifuge and bucket size |
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | |
| Phosphate citrate buffer | Sigma | P4922 | |
| o-phenylenediamine dihydrochloride | Sigma | P8287 | |
| 0.22 μm vacuum filter top (500 mL) | Nalgene | 569-0020 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| H2SO4 | Sigma | 339741 | |
| Sf-900 II SFM | ThermoFisher Scientific | 10902-096 |
Riferimenti
- Zeltins, A. Construction and characterization of virus-like particles: a review. Mol Biotechnol. 53, 92-107 (2013).
- Jain, N. K., et al. Formulation and stabilization of recombinant protein based virus-like particle vaccines. Adv Drug Deliv Rev. , (2014).
- Mair, C. M., Ludwig, K., Herrmann, A., Sieben, C. Receptor binding and pH stability – how influenza A virus hemagglutinin affects host-specific virus infection. Biochim. Biophys. Acta. 1838, 1153-1168 (2014).
- . Engerix-B package insert. GlaxoSmithKline, Research Triangle Park, NC. , (2013).
- Giles, B. M., et al. A computationally optimized hemagglutinin virus-like particle vaccine elicits broadly reactive antibodies that protect nonhuman primates from H5N1 infection. J Infect Dis. 205, 1562-1570 (2012).
- Giles, B. M., Ross, T. M. A computationally optimized broadly reactive antigen (COBRA) based H5N1 VLP vaccine elicits broadly reactive antibodies in mice and ferrets. Vaccine. 29, 3043-3054 (2011).
- Green, T. D., et al. C3d enhancement of neutralizing antibodies to measles hemagglutinin. Vaccine. 20, 242-248 (2001).
- Bright, R. A., et al. Cross-Clade Protective Immune Responses to Influenza Viruses with H5N1 HA and NA Elicited by an Influenza Virus-Like Particle. PLoS ONE. 3, e1501 (2008).
- Yondola, M. A., et al. Budding Capability of the Influenza Virus Neuraminidase Can Be Modulated by Tetherin. J Virol. 85, 2480-2491 (2011).
- Schneider-Ohrum, K., Ross, T. M. Virus-like particles for antigen delivery at mucosal surfaces. Curr Top Microbiol Immunol. 354, 53-73 (2012).
- Murawski, M. R., et al. Newcastle disease virus-like particles containing respiratory syncytial virus G protein induced protection in BALB/c mice, with no evidence of immunopathology. J Virol. 84, 1110-1123 (2010).
- Quan, F. S., et al. Viruslike particle vaccine induces protection against respiratory syncytial virus infection in mice. J Infect Dis. 204, 987-995 (2011).
- Ross, T. M., Tang, X., Lu, H. R., Olagnier, D., Kirchenbaum, G. A., Evans, J. D. COBRA-Based Dengue Tetravalent Vaccine Elicits Neutralizing Antibodies Against All Four Dengue Serotypes. J Vaccine Immunotechnology. 1 (7), (2014).
- . Manual for the Laboratory Diagnosis and Virological Surveillance of Influenza. World Health Organization. , (2011).
- Mitnaul, L. J., et al. Balanced Hemagglutinin and Neuraminidase Activities Are Critical for Efficient Replication of Influenza A Virus. J Virol. 74, 6015-6020 (2000).
- Jarvis, D. L. . Methods in Enzymology. 463, 191-222 (2009).
- Pijlman, G. P. Enveloped virus-like particles as vaccines against pathogenic arboviruses. Biotechnol J. 10, 659-670 (2015).
- Park, J. K., et al. Protective efficacy of crude virus-like particle vaccine against HPAI H5N1 in chickens and its application on DIVA strategy. Influenza Other Respir Viruses. 7, 340-348 (2013).
- Gangadharan, D., Smith, J., Weyant, R. Biosafety Recommendations for Work with Influenza Viruses Containing a Hemagglutinin from the A/goose/Guangdong/1/96 Lineage. MMWR. Recommendations and reports : Morbidity and mortality weekly report. Recommendations and reports / Centers for Disease Control. 62, 1-7 (2013).
