Expressie en zuivering van virusachtige deeltjes voor vaccinatie
Summary
Hier presenteren we een protocol voor het synthetiseren van virusachtige deeltjes met behulp van baculovirus of zoogdierlijke expressiesystemen en ultracentrifugatie zuivering. Deze zeer flexibele aanpak wordt gebruikt om virale antigenen vaccin taakstellingen op veilige en soepele wijze.
Abstract
Virusachtige deeltjes (VLP's) en subvirale deeltjes (SVP) een alternatieve benadering voor virale vaccins die de voordelen van een verhoogde biologische veiligheid en stabiliteit op het gebruik van levende pathogenen heeft. Niet-infectieuze en zelfassemblerende VLP's worden gebruikt voor structurele eiwitten presenteren als immunogenen, het omzeilen van de behoefte aan levende pathogenen of recombinante virale vectoren voor antigeen-afgifte. In dit artikel tonen we de verschillende stadia van VLP ontwerp en ontwikkeling voor toekomstige toepassingen in preklinische dierproeven. De procedure omvat de volgende stadia: selectie van antigeen expressie van antigeen in cellijn naar keuze, zuivering van VLP's / SVP en kwantificering van antigeen doseren. We demonstreren gebruik van zowel zoogdieren en insecten cellijnen voor expressie van onze antigenen en tonen hoe methoden verschillen opbrengst. De gepresenteerde methode kan voor een verscheidenheid aan pathogenen en kan worden bereikt door het substitueren van de immunogene antigenen met structural eiwitten van micro-organisme van het belang van de gebruiker. VLP's en SVP helpen met antigeen karakterisering en selectie van de beste kandidaat-vaccins.
Introduction
Virusachtige deeltjes (VLP's) zijn een erkende technologie voor de vaccinatie van mensen. In feite zijn sommige van de meer eigentijdse geregistreerde vaccins, zoals de menselijke papillomavirus (HPV) en hepatitis Β (HepΒ) vaccins gebruiken deze aanpak. VLP's worden gevormd uit structurele eiwitten die in staat zelf te monteren. De samengestelde deeltjes nabootsen virale morfologie, maar kan infecteren of te repliceren, omdat ze geen virale genomen. VLP's kunnen tot expressie worden gebracht en gezuiverd uit een aantal prokaryotische en eukaryotische systemen. Een overzicht van de literatuur is gebleken dat verschillende expressie systemen worden ingezet tegen de volgende tarieven: bacteriën – 28%, gist – 20%, plant – 9%, insect – 28%, en van zoogdieren – 15% 1. Van de nota, zijn HPV-vaccins gebaseerd op L1 capside-eiwit geproduceerd in gist (Gardasil) of in een insect cel systeem (Cervarix) 2. HepΒ vaccins Recombivax en Engerix-Β, worden geproduceerd in gist, en bestaan uit HepΒ oppervlakteantigeen 3, 4.
We gebruiken zoogdier- en insectencellen-expressiesystemen tot VLP's die co-expressie van meerdere eiwitten voor structurele assemblage produceren. Ons werk richt zich op het ontwerpen, produceren en zuiveren-VLP gebaseerde vaccins tegen menselijke pathogenen: griepvirus, respiratoir syncytieel virus (RSV), dengue virus (DENV) en chikungunya-virus (CHIKV). De methoden zijn flexibel genoeg om voor co-expressie van meerdere structurele eiwitten van verschillende expressieplasmiden of een expressieplasmide (figuur 1). Eerder hebben we geproduceerd en gezuiverd H5N1 VLP's opgebouwd uit de co-expressie van plasmiden die coderen voor influenza hemagglutinine (HA), neuraminidase (NA) en matrix (M1) in humane embryonale nier 293T-cellen 5,6. De genen werden codon geoptimaliseerd voor expressie in zoogdiercellen en gekloneerd in pTR600, een eukaryotische expressievector die de cytomegalovirus immediate-early promotor plus intron A voor het initiëren Transcription van eukaryote inserts en runderen groeihormoon polyadenyleringssignaal voor beëindiging van de transcriptie 7. Een vergelijkbare benadering met behulp van drie plasmide co-expressie van HA, NA (figuur 1A) en een andere virale matrix eiwit, HIV Gag p55, werd gebruikt voor het verkrijgen van seizoensgebonden influenzasubtype menselijke H3N2 VLP's in dit onderzoek en blijkt genereren VLP's van soortgelijke grootte als influenza deeltjes 8. Hoewel griepvaccins hoofdzakelijk opwekken anti-HA-antilichamen, de toevoeging van griep neuraminidase bemiddelt sialidase activiteit VLP budding uit getransfecteerde cellen en 9 aanwezig additionele immunogene targets mogelijk. RSV VLP produceren we ook de geselecteerde verbonden kern van HIV Gag prototypische vaccins die uitsluitend RSV-glycoproteïnen van het oppervlak presenteren verder aan te tonen flexibiliteit van VLP-vorming middels HIV Gag, zoals eerder beschreven en gekenmerkt door elektronenmicroscopie 6,10 ontwerpen. anderenhebben eerder aangetoond dat VLP presenteren RSV-glycoproteïnen kunnen worden geassembleerd met behulp van verscheidene virale componenten van Newcastle Disease virus (NDV) 11 en 12 influenza matrix. Full-length oppervlakte glycoproteïne sequenties werden gebruikt in deze studie natieve conformaties die noodzakelijk zijn voor receptorbinding en functionele antilichaamherkenning assay kan worden door middel van enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) behouden.
Onze voorbeelden voor het gebruik van enkel plasmide expressie systemen om deeltjes te genereren DENV en CHIKV. Bij DENV, kunnen we subvirale deeltjes (SVP) zonder capside in 293T cellen van een plasmide dat een prM / E structurele genexpressiecassette 13 produceren. De term SVP wordt gebruikt om het gebrek aan een kern- of capside-eiwit in de assemblage van virale structurele proteïnen duiden. CHIK VLP's kunnen ook worden geproduceerd met een plasmide dat een structureel gen CHIKV cassette codeert capside en envelop eiwitten of insect cellen door het infecteren met een recombinant baculovirus coderend voor hetzelfde gen cassette structureel geoptimaliseerd voor insectencel expressie (Figuur 1B – C).
Het eindresultaat van de expressie benaderingen hierboven besproken is het vrijkomen van VLP's in celkweekmedium dat dan via ultracentrifugatie kan worden gezuiverd door een 20% glycerol kussen. In dit rapport presenteren we methoden om uit te drukken en te zuiveren van deze VLP's van zoogdieren en insecten cel systemen.
Protocol
Representative Results
Discussion
We hebben de hierboven beschreven technieken die worden gebruikt om met succes uit te drukken en te zuiveren SVP en VLP samengesteld uit meerdere structurele eiwitten van verschillende ziekteverwekkers. In het algemeen gebruiken we zoogdierexpressiesystemen onze VLP's te genereren. Echter, in onze handen, zoogdieren cel afkomstige CHIK VLP opbrengsten waren laag. CHIK VLP opbrengst was robuuster bij het gebruik van een recombinant baculovirus-insectencel systeem. In het algemeen baculovirus-insectencel systemen leve…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We willen de voorafgaande leden van de Ross lab die hebben geholpen optimaliseren protocol voor maximale efficiëntie en opbrengst erkennen.
Materials
| Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12163 | |
| DMEM | Cellgro | 10-013 | |
| Lipofectamine | Life Technologies | L3000075 | Lipofectamine 2000, Lipofectamine 3000 |
| Opti-MEM I | Life Technologies | 31985062 | |
| Bac-to-Bac Baculovirus Expression System | Life Technologies | 10359-016 | |
| Cimarec I 6 multipoint stirrer plate | ThermoFisher Scientific | 50094596 | |
| Polyclear ultracentrifuge tubes | Seton | 7025 | Confirm appropriate tubes for ultracentrifuge and bucket size |
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | |
| Phosphate citrate buffer | Sigma | P4922 | |
| o-phenylenediamine dihydrochloride | Sigma | P8287 | |
| 0.22 μm vacuum filter top (500 mL) | Nalgene | 569-0020 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| H2SO4 | Sigma | 339741 | |
| Sf-900 II SFM | ThermoFisher Scientific | 10902-096 |
Riferimenti
- Zeltins, A. Construction and characterization of virus-like particles: a review. Mol Biotechnol. 53, 92-107 (2013).
- Jain, N. K., et al. Formulation and stabilization of recombinant protein based virus-like particle vaccines. Adv Drug Deliv Rev. , (2014).
- Mair, C. M., Ludwig, K., Herrmann, A., Sieben, C. Receptor binding and pH stability – how influenza A virus hemagglutinin affects host-specific virus infection. Biochim. Biophys. Acta. 1838, 1153-1168 (2014).
- . Engerix-B package insert. GlaxoSmithKline, Research Triangle Park, NC. , (2013).
- Giles, B. M., et al. A computationally optimized hemagglutinin virus-like particle vaccine elicits broadly reactive antibodies that protect nonhuman primates from H5N1 infection. J Infect Dis. 205, 1562-1570 (2012).
- Giles, B. M., Ross, T. M. A computationally optimized broadly reactive antigen (COBRA) based H5N1 VLP vaccine elicits broadly reactive antibodies in mice and ferrets. Vaccine. 29, 3043-3054 (2011).
- Green, T. D., et al. C3d enhancement of neutralizing antibodies to measles hemagglutinin. Vaccine. 20, 242-248 (2001).
- Bright, R. A., et al. Cross-Clade Protective Immune Responses to Influenza Viruses with H5N1 HA and NA Elicited by an Influenza Virus-Like Particle. PLoS ONE. 3, e1501 (2008).
- Yondola, M. A., et al. Budding Capability of the Influenza Virus Neuraminidase Can Be Modulated by Tetherin. J Virol. 85, 2480-2491 (2011).
- Schneider-Ohrum, K., Ross, T. M. Virus-like particles for antigen delivery at mucosal surfaces. Curr Top Microbiol Immunol. 354, 53-73 (2012).
- Murawski, M. R., et al. Newcastle disease virus-like particles containing respiratory syncytial virus G protein induced protection in BALB/c mice, with no evidence of immunopathology. J Virol. 84, 1110-1123 (2010).
- Quan, F. S., et al. Viruslike particle vaccine induces protection against respiratory syncytial virus infection in mice. J Infect Dis. 204, 987-995 (2011).
- Ross, T. M., Tang, X., Lu, H. R., Olagnier, D., Kirchenbaum, G. A., Evans, J. D. COBRA-Based Dengue Tetravalent Vaccine Elicits Neutralizing Antibodies Against All Four Dengue Serotypes. J Vaccine Immunotechnology. 1 (7), (2014).
- . Manual for the Laboratory Diagnosis and Virological Surveillance of Influenza. World Health Organization. , (2011).
- Mitnaul, L. J., et al. Balanced Hemagglutinin and Neuraminidase Activities Are Critical for Efficient Replication of Influenza A Virus. J Virol. 74, 6015-6020 (2000).
- Jarvis, D. L. . Methods in Enzymology. 463, 191-222 (2009).
- Pijlman, G. P. Enveloped virus-like particles as vaccines against pathogenic arboviruses. Biotechnol J. 10, 659-670 (2015).
- Park, J. K., et al. Protective efficacy of crude virus-like particle vaccine against HPAI H5N1 in chickens and its application on DIVA strategy. Influenza Other Respir Viruses. 7, 340-348 (2013).
- Gangadharan, D., Smith, J., Weyant, R. Biosafety Recommendations for Work with Influenza Viruses Containing a Hemagglutinin from the A/goose/Guangdong/1/96 Lineage. MMWR. Recommendations and reports : Morbidity and mortality weekly report. Recommendations and reports / Centers for Disease Control. 62, 1-7 (2013).
