Tümör mikroçevresinde Gerçek zamanlı Multisellüler Dynamics Genişletilmiş Time-lapse intravital Görüntüleme
Summary
Bu protokol, tek bir hücre çözünürlükte in vivo olarak, gerçek zamanlı olarak çok-etkileşimlerin uzatılmış zaman atlamalı görüntüleme gerçekleştirmek için multiphoton mikroskobu kullanımını tarif eder.
Abstract
In the tumor microenvironment, host stromal cells interact with tumor cells to promote tumor progression, angiogenesis, tumor cell dissemination and metastasis. Multicellular interactions in the tumor microenvironment can lead to transient events including directional tumor cell motility and vascular permeability. Quantification of tumor vascular permeability has frequently used end-point experiments to measure extravasation of vascular dyes. However, due to the transient nature of multicellular interactions and vascular permeability, the kinetics of these dynamic events cannot be discerned. By labeling cells and vasculature with injectable dyes or fluorescent proteins, high-resolution time-lapse intravital microscopy has allowed the direct, real-time visualization of transient events in the tumor microenvironment. Here we describe a method for using multiphoton microscopy to perform extended intravital imaging in live mice to directly visualize multicellular dynamics in the tumor microenvironment. This method details cellular labeling strategies, the surgical preparation of a mammary skin flap, the administration of injectable dyes or proteins by tail vein catheter and the acquisition of time-lapse images. The time-lapse sequences obtained from this method facilitate the visualization and quantitation of the kinetics of cellular events of motility and vascular permeability in the tumor microenvironment.
Introduction
primer meme tümörü tümör hücrelerinin yayılması makrofajlar ve endotel hücreleri dahil olmak üzere stromal hücreler sadece tümör hücrelerini içerir, ancak ana bilgisayar gösterilmiştir. Bundan başka, tümör damar sistemi artan geçirgenliği 1 anormaldir. Bu durumda, tümör hücreleri, makrofajlar ve endotelial hücreler, primer tümör mikro-vasküler geçirgenliği ve tümör hücre intravasation aracılık etkileşim belirleyen anlaşılması metastaz için önemlidir. damar geçirgenliği, tümör hücre intravazasyonunda ve tümör mikroçevresinde çok hücreli etkileşimler altında yatan sinyal mekanizmasının kinetik anlama anti-kanser tedavilerinin geliştirilmesine ve yönetiminde önemli bilgiler sağlayabilir.
In vivo olarak tümör damar geçirgenliğini incelemek birincil yöntemi Evans Mavi 2, yüksek molekül ağırlıklı dekstranlar (155 kDa) halinde ekstravasküler boyalar ölçülmesi olmuşturBoyanın enjeksiyonundan sonra sabit bir zaman noktalarında 3 ve florofor ya da (albümin dahil) Radyoaktif-konjüge proteinler 4. Mikroskopi Gelişmeler, hayvan modelleri ve floresan boyalar intravital mikroskobiyle 5 boyunca hücresel süreçleri ve canlı hayvan vasküler geçirgenliğin görselleştirme sağlamıştır.
Birkaç kez puan üzerinden statik görüntülerin, ya da kısa time-lapse dizilerinin satın alarak Canlı hayvan görüntüleme tümörün mikro 6,7 dinamik olayların anlaşılması için izin vermez. Nitekim, 24 saat boyunca statik bir görüntü elde etme tümör damar ancak damar geçirgenliği dinamikleri 6 gözlenmemiştir, sızdıran olduğunu göstermiştir. Böylece, 12 saate kadar uzatılmış sürekli time-lapse görüntüleme tümör mikroçevresinde dinamik olayların kinetik yakalar.
Bu protokol, uzun bir zaman atlamalı multiphot kullanımını tarif ederintravital mikroskopi tümör mikro-dinamik çok hücreli olayları incelemek için. tümör mikroçevresinde birden fazla hücre tipleri enjekte edilebilir boyalarla veya floresan proteinleri ifade transgenik hayvanlar kullanılarak etiketlenir. vasküler boyalar veya proteinler görüntüleme başladıktan sonra enjekte edilebilir bir kuyruk damarından sonda kullanılarak tümör mikro çok hücreli olayların kinetik veriler elde etmek için. canlı hücre görüntüleme için meme tümörü deri bir kapakla cerrahi hazırlık aracılığıyla maruz kalmaktadır. Görüntüler birden photomultiplier tüpler (PMT) dedektörleri 8 ile donatılmış bir multiphoton mikroskop kullanarak 12 saate kadar için edinilir. Uygun filtreleri kullanarak, bir çıkarma algoritması tümörün mikro aynı anda 9 5 floresan sinyalleri elde etmek 4 PMT dedektörleri sağlar. Yüksek çözünürlüklü multiphoton İntra vital mikroskopik daha iyi bir yol, tümörün mikro tümör stromanın etkileşimleri, tek bir hücre çözünürlüklü görüntü yakalar Uvasküler geçirgenlik ve tümör hücre intravasation 10-13 nderstanding. Spesifik olarak, bir tümör hücresi, bir makrofaj ve endotel hücre arasındaki etkileşimi bölgelerde seçici meydana genişletilmiş intravital görüntüleme ortaya yüksek derecede lokalize edilen, geçici vasküler geçirgenlik etkinlik 13 (metastaz, TMEM 14 tümör mikro-olarak tanımlanmıştır). Bundan başka, tümör hücre intravasation, sadece TMEM gerçekleşir ve uzamsal ve geçici olarak vasküler geçirgenliği 13 ile ilişkilidir. Bu olayların dinamiklerinin tek hücreli çözünürlükte tümör mikroçevresinde floresan işaretli hücrelerin uzun time-lapse multiphoton mikroskobu kullanımı ile mümkün olmuştur.
Protocol
Representative Results
Discussion
tümör mikroçevresinde kendiliğinden meydana gelen hücresel etkileşimler, tümör hücre hareketliliği ve intravasation değişikliklere yol açabilir. Canlı tümör dokusunun yüksek çözünürlüklü intravital görüntüleme son derece geçici 10,13,24 olabilir çok hücreli dinamikleri görselleştirme izin verir. Tümörün mikro süreçlerin moleküler mekanizmaları hakkında gerekli bilgi verebilir ayrık zamanlı noktaları ile elde edilen in vivo deneylerde veya time-lapse gör?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma ödül sayısı (ASH, W81XWH-13-1-0010) kapsamında Savunma Bakanlığı Meme Kanseri Araştırma Programı, NIH CA100324, PPG CA100324 ve Entegre Görüntüleme Programı tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 155 kDa dextran-tetramethylrhodamine isothiocyanate | Sigma Aldrich | T1287 | reconstitute at 20 mg/mL in 1 X PBS |
| 70 kDa dextran-Texas Red | Life Technologies | D-1830 | reconstitute at 10 mg/mL in 1 X PBS |
| 10 kDa dextran-fluorescein isothyocyanate | Sigma Aldrich | FD10S | reconstitute at 20 mg/mL in 1 X PBS |
| Qdot 705 ITK Amino (PEG) Quantum Dots | Life Technologies | Q21561MP | Dilute 25 uL in 175 uL of 1 X PBS for injection |
| MMTV-PyMT mice | Jackson Laboratory | 2374 | |
| Csf1r-ECFP mice (Csf1r-Gal4/VP16,UAS-ECFP) | Jackson Laboratory | 26051 | |
| Csf1r-EGFP mice | Jackson Laboratory | 18549 | |
| 1 x PBS | Life Technologies | ||
| Isoethesia (isoflurane) | Henry Schein Animal Health | 50033 | 250 mL |
| Oxygen | AirTech | ||
| 1 mL syringe, tuberculin slip tip | BD | 309659 | |
| 30G x 1 (0.3 mm X 25 mm) needle | BD | 305128 | |
| Polyethylene micro medical tubing | Scientific Commodities Inc | BB31695-PE/1 | 0.28 mm I.D. X 0.64 mm O.D. |
| Microscope coverglass | Corning | 2980-225 | thickness 1.5, 22 X 50 mm |
| MouseOx oximeter, software and sensors | STARR Life Sciences | ||
| Laboratory tape | Fisher Scientific | 159015R | |
| soft rubber pad | McMaster-Carr | 8514K62 | Ultra-Soft Polyurethane Film, 3/16” Thick, 12" x 12", 40 Oo Durometer, Plain Back |
| hard rubber pad | McMaster-Carr | 8568K615 | High-Strength Neoprene Rubber Sheet 1/4" Thick, 12" X 12", 50A Durometer, |
| Microscope | Olympus | The microscope is a custom built two laser multiphoton microscope based on an Olympus IX-71 stand utilizing a 20x 1.05NA objective lens. | |
| 7-Punch set | McMaster-Carr | 3429A12 | , 1/4" to 1" Hole Diameter, for Hammer-Driven Hole Punch, |
Riferimenti
- Gerlowski, L. E., Jain, R. K. Microvascular permeability of normal and neoplastic tissues. Microvasc Res. 31 (3), 288-305 (1986).
- Wang, H. -. L., Lai, T. W. Optimization of Evans blue quantitation in limited rat tissue samples. Sci Rep. 4, (2014).
- Dvorak, H. F. Rous-Whipple Award Lecture. How tumors make bad blood vessels and stroma. Am J Pathol. 162 (6), 1747-1757 (2003).
- Nagy, J. A., et al. Permeability properties of tumor surrogate blood vessels induced by VEGF-A. Lab Invest. 86 (8), 767-780 (2006).
- Egawa, G., et al. Intravital analysis of vascular permeability in mice using two-photon microscopy. Sci Rep. 3, (2013).
- Yuan, F., et al. Vascular permeability in a human tumor xenograft: molecular size dependence and cutoff size. Cancer Res. 55 (17), 3752-3756 (1995).
- Dellian, M., Yuan, F., Trubetskoy, V. S., Torchilin, V. P., Jain, R. K. Vascular permeability in a human tumour xenograft: molecular charge dependence. Br J Cancer. 82 (9), 1513-1518 (2000).
- Entenberg, D., et al. Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging. Nat Protocols. 6 (10), 1500-1520 (2011).
- Entenberg, D., et al. Imaging tumor cell movement in vivo. Curr Protoc Cell Biol. Chapter. 19, (2013).
- Patsialou, A., et al. Intravital multiphoton imaging reveals multicellular streaming as a crucial component of in vivo. cell migration in human breast tumors. Intravital. 2 (2), e25294 (2013).
- Gligorijevic, B., Bergman, A., Condeelis, J. Multiparametric classification links tumor microenvironments with tumor cell phenotype. PLoS Biol. 12 (11), e1001995 (2014).
- Roussos, E. T., et al. Mena invasive (MenaINV) promotes multicellular streaming motility and transendothelial migration in a mouse model of breast cancer. J Cell Sci. 13, 2120-2131 (2011).
- Harney, A. S., et al. Real-Time Imaging Reveals Local, Transient Vascular Permeability, and Tumor Cell Intravasation Stimulated by TIE2hi Macrophage-Derived VEGFA). Cancer Discov. 5 (9), 932-943 (2015).
- Robinson, B. D., et al. Tumor microenvironment of metastasis in human breast carcinoma: a potential prognostic marker linked to hematogenous dissemination. Clin Cancer Res. 15, 2433-2441 (2009).
- Sasmono, R. T., et al. A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse. Blood. 101 (3), 1155-1163 (2003).
- Ovchinnikov, D. A., et al. Expression of Gal4-dependent transgenes in cells of the mononuclear phagocyte system labeled with enhanced cyan fluorescent protein using Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP double-transgenic mice. J Leukcocyte Biol. 83 (2), 430-433 (2008).
- Liu, H., et al. Cancer stem cells from human breast tumors are involved in spontaneous metastases in orthotopic mouse models. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (42), 18115-18120 (2010).
- Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer. J Vis Exp. (73), (2013).
- Weis, S., Cui, J., Barnes, L., Cheresh, D. Endothelial barrier disruption by VEGF-mediated Src activity potentiates tumor cell extravasation and metastasis. J Cell Biol. 167 (2), 223-229 (2004).
- Wyckoff, J., Gligorijevic, B., Entenberg, D., Segall, J., Condeelis, J. High-Resolution Multiphoton Imaging of Tumors. In Vivo. Cold Spring Harb Protoc. (10), (2011).
- Lathia, J. D., et al. Direct in vivo. evidence for tumor propagation by glioblastoma cancer stem cells. PLoS One. 6 (9), e24807 (2011).
- Nakasone, E. S., et al. Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance. Cancer Cell. 21 (4), 488-503 (2012).
- Dreher, M. R., et al. Tumor vascular permeability, accumulation, and penetration of macromolecular drug carriers. J Natl Cancer Inst. 98 (5), 335-344 (2006).
- Wyckoff, J. B., et al. Direct visualization of macrophage-assisted tumor cell intravasation in mammary tumors. Cancer Res. 67 (6), 2649-2656 (2007).
- Chittajallu, D. R., et al. In vivo. cell-cycle profiling in xenograft tumors by quantitative intravital microscopy. Nat Methods. 12 (6), 577-585 (2015).
- Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nat Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
- Yano, S., et al. Spatial-temporal FUCCI imaging of each cell in a tumor demonstrates locational dependence of cell cycle dynamics and chemoresponsiveness. Cell Cycle. 13 (13), 2110-2119 (2014).
- Yang, M., Jiang, P., Hoffman, R. M. Whole-body subcellular multicolor imaging of tumor-host interaction and drug response in real time. Cancer Res. 67 (11), 5195-5200 (2007).
- Manning, C. S., et al. Intravital imaging reveals conversion between distinct tumor vascular morphologies and localized vascular response to Sunitinib. Intravital. 2 (1), 24790 (2013).
- Alexander, S., Koehl, G. E., Hirschberg, M., Geissler, E. K., Friedl, P. Dynamic imaging of cancer growth and invasion: a modified skin-fold chamber model. Histochem Cell Biol. 130 (6), 1147-1154 (2008).
- Brown, E. B., et al. In vivo. measurement of gene expression, angiogenesis and physiological function in tumors using multiphoton laser scanning microscopy. Nat Med. 7 (7), 864-868 (2001).
