De un solo paso negativo Purificación cromatográfica de<em> Helicobacter pylori</em> La proteína activadora de neutrófilos sobreexpresa en<em> Escherichia coli</em> En modo batch
Summary
Un método de alto rendimiento para la purificación negativa de un solo paso de Helicobacter pylori recombinante proteína activadora de neutrófilos (HP-PAN) sobreexpresado en Escherichia coli mediante el uso de resinas de dietilaminoetilo en modo batch se describe. HP-PAN purificado por este método es beneficioso para el desarrollo de vacunas, medicamentos o diagnósticos para H. pylori -asociado enfermedades.
Abstract
Helicobacter pylori proteína activadora de neutrófilos (HP-PAN) es un importante factor de virulencia de Helicobacter pylori (H. pylori). Desempeña un papel crítico en H. pylori inducida por inflamación gástrica mediante la activación de varios leucocitos innatos incluyendo neutrófilos, monocitos y mastocitos. Las propiedades inmunogénicas e inmunomoduladoras de HP-NAP lo convierten en un candidato potencial de diagnóstico y de vacuna para H. pylori y un nuevo fármaco candidato para la terapia del cáncer. Con el fin de obtener cantidades sustanciales de purificado HP-NAP utilizado por sus aplicaciones clínicas, un método eficaz para purificar esta proteína con alto rendimiento y pureza necesita ser establecido.
En este protocolo, hemos descrito un método para una sola etapa de purificación cromatográfica negativo de HP-NAP recombinante sobreexpresada en Escherichia coli (E. coli) mediante el uso de dietilaminoetilo resinas de intercambio iónico (DEAE) (por ejemplo., Sephadex) iel modo por lotes n. Recombinante HP-PAN constituye casi el 70% del total de proteínas en E. coli y está casi completamente recuperado en la fracción soluble tras la lisis celular a un pH de 9,0. Bajo la condición óptima a pH 8,0, la mayoría de HP-NAP se recupera en la fracción no unida, mientras que las proteínas endógenas de E. coli se eliminan de manera eficiente por la resina.
Este método de purificación mediante cromatografía de lote modo negativo con resinas de intercambio iónico DEAE produce funcional HP-NAP de E. coli en su forma nativa con alto rendimiento y pureza. El HP-PAN purificada podría ser utilizado más para la prevención, tratamiento y pronóstico de la H. pylori -asociado enfermedades, así como la terapia del cáncer.
Introduction
Helicobacter pylori (H. pylori) es una causa importante de gastritis y úlcera péptica. Esta bacteria también ha sido clasificado como un carcinógeno en humanos por parte de la Agencia Internacional para la Investigación sobre el Cáncer, que forma parte de la Organización Mundial de la Salud, en el año 1994. Se ha estimado que la prevalencia de H. pylori es del 70% en los países en desarrollo y del 30-40% en los países industrializados 1. A pesar de que la tasa de infección de H. pylori está disminuyendo en los países industrializados, la tasa de infección de H. pylori en los países en desarrollo sigue siendo alta 2. El tratamiento estándar para erradicar H. pylori consiste en la administración de un inhibidor de la bomba de protones, IBP y dos antibióticos, claritromicina o metronidazol más amoxicilina 3. Sin embargo, el aumento de la resistencia a los antibióticos en H. pylori relacionados con la PI terapia de úlceras insta al desarrollo de nuevas estrategias para prevenir or curar la infección. Desarrollo de la vacunación preventiva y / o terapéutica contra H. pylori podría proporcionar un enfoque alternativo para el control de H. pylori.
Helicobacter pylori proteína activadora de neutrófilos (NAP-HP), un importante factor de virulencia de H pylori, se identificó por primera vez en extractos de agua de H. pylori con la capacidad de activar los neutrófilos a adherirse a las células endoteliales y producir especies de oxígeno reactivas (ROS) 4. La infiltración de neutrófilos de la mucosa gástrica se encuentra en H. pylori pacientes infectados con gastritis activa pueden resultar en la inflamación y el daño tisular del estómago. Por lo tanto, HP-NAP puede jugar un papel patológico mediante la activación de los neutrófilos para inducir inflamación gástrica, lo que hace aún más úlcera o H. pylori -asociado enfermedades gástricas. Sin embargo, HP-PAN es un candidato potencial para aplicaciones clínicas 5,6. Debido a la pro inmunogénica e inmunomoduladorpiedades de HP-NAP, esta proteína se podrían utilizar para desarrollar vacunas, agentes terapéuticos, y herramientas de diagnóstico. Un ensayo clínico se ha realizado para el uso de HP-NAP recombinante como uno de los componentes de una vacuna de proteína contra H. pylori. Esta vacuna consiste en HP-NAP recombinante, asociado a la citotoxina gen A (CagA), y las proteínas vacuolizante citotoxina A (VacA) formulado con hidróxido de aluminio y además se ha demostrado que es segura e inmunogénica en humanos 7. Además, HP-PAN actúa como un potente inmunomodulador para desencadenar T auxiliares de tipo 1 (Th1) -polarized respuestas inmunes para la terapia del cáncer 8 y para regular hacia abajo las respuestas inmunitarias mediadas por Th2 provocadas por reacciones alérgicas e infecciones parasitarias 9,10. Como para el diagnóstico, recombinante ELISA basado en HP-PAN se ha aplicado a la detección de anticuerpos séricos contra HP-NAP en H. pylori pacientes infectados 11. Un estudio mostró que el nivel de anticuerpos HP-PAN-específica en sueros de H. pylori pacientes infectados con cáncer gástrico fue significativamente mayor que la de los pacientes con gastritis crónica 12. Otro estudio también demostró que los anticuerpos séricos contra HP-NAP se asocian con la presencia de no cardia adenocarcinoma gástrico 13. Por lo tanto, recombinante ELISA basado en HP-NAP se puede aplicar a la detección de anticuerpos séricos contra HP-NAP para el pronóstico del cáncer gástrico en H. pylori pacientes infectados. En su conjunto, el HP-PAN purificada podría ser utilizado más para la prevención, tratamiento y pronóstico de la H. pylori -asociado enfermedades, así como la terapia del cáncer.
Entre los diversos métodos utilizados para la purificación de recombinante HP-NAP expresado en Escherichia coli (E. coli) en su forma nativa informado hasta ahora, se necesita una cromatografía de filtración en gel segunda etapa de purificación que implica obtener alta pureza HP-NAP 14-16 . Aquí, un método que utiliza cromatografía de modo por lotes negativa condietilaminoetilo (DEAE) resinas de intercambio iónico se describe para la purificación de HP-NAP sobreexpresa en E. coli con alto rendimiento y alta pureza. Esta técnica de purificación se basa en la unión de proteínas y / o impurezas que no sean HP-PAN a la resina de la célula huésped. A pH 8,0, casi no hay otras proteínas, excepto HP-NAP se recuperan de la fracción no unida. Este enfoque purificación utilizando cromatografía de intercambio iónico de DEAE en el modo negativo es simple y ahorrando al permitir la purificación de HP-PAN recombinante mediante cromatografía de un solo paso a través de la recogida de la fracción no unida tiempo. Además de HP-NAP, varias otras biomoléculas, tales como virus 17, la inmunoglobulina G (IgG) 18, la hemoglobina 19, la proteína fosfatasa 20, y el factor de virulencia flagelina 21, también se han informado de que se purificó por cromatografía de intercambio de iones en negativo modo. Se prefiere el modo negativo para la cromatografía de intercambio iónico, si las impurezas son el menorcomponentes presentes en la muestra sometida a purificarse 22. La aplicación de la cromatografía negativo en la purificación de biomoléculas naturales o recombinantes se ha revisado recientemente 23.
El presente informe ofrece un paso a paso el protocolo para la expresión de HP-PAN recombinante en E. coli, lisis de las células, y la purificación de HP-NAP usando cromatografía por lotes modo negativo con resinas de intercambio iónico de DEAE. Si una proteína deseada para la purificación es adecuado para cromatografía de intercambio iónico en el modo negativo, el protocolo descrito también podría ser adaptado como punto de partida para el desarrollo de un proceso de purificación.
Protocol
Representative Results
Discussion
La cromatografía por lotes modo negativo con resinas de intercambio aniónico DEAE que aquí se presenta es adecuado para la purificación de HP-NAP recombinante sobreexpresada en E coli. Los valores de pH de los tampones utilizados en las etapas de lisis celular y la purificación son muy críticos para asegurar la solubilidad de HP-NAP en E. Los lisados de E. coli y la separación eficiente de HP-NAP recombinante a partir de las impurezas de la célula huésped, respectivamente. Las c…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Chao-Sheng Cheng at National Tsing Hua University, Taiwan, for performing the circular dichroism measurement. We also thank Drs. Evanthia Galanis and Ianko D. Iankov at Mayo Clinic, USA, for providing the anti-HP-NAP monoclonal antibody. We appreciate Drs. Han-Wen Chang and Chung-Chu Chen at Mackay Memorial Hospital, Hsinchu, Taiwan, for providing advice for IRB application, Mr. Te-Lung Tsai at the Mackay Memorial Hospital, Hsinchu, Taiwan, for supervising the analysis of isolated neutrophils, and Ms. Ju-Chen Weng at National Tsing Hua University, Taiwan, for her technical assistance. This work was supported by grants from the Ministry of Science and Technology of Taiwan (MOST 104-2311-B-007-003, NSC101-2311-B-007-007 and NSC98-2311-B-007-006-MY3), the Joint Research Program of National Tsing Hua University and Mackay Memorial Hospital (100N7727E1, 101N2727E1, 103N2773E1), and the research program of National Tsing Hua University (104N2052E1).
Materials
| Material | |||
| pET42a-NAP | N/A | N/A | prepared as described in Supplementary data of Refernce 15 http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0006291X08018317 |
| E. coli BL21 (DE3) | Thermo Fisher Scientific Inc | C6000-03 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/C600003 |
| Kanamycin | Amresco | 25389-94-0 | http://www.amresco-inc.com/KANAMYCIN-SULFATE-0408.cmsx |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | MD Biomedical Inc | 101-367-93-1 | http://www.antibody-antibodies.com/product_det.php?id=238064&supplier=search&name =IPTG%20 |
| phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | 10837091001 | protease inhibitor http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/PMSFRO?lang=en®ion=TW |
| N-alpha-tosyl-L-lysinyl-chloromethylketone (TLCK) | Sigma-Aldrich | T7254 | protease inhibitor http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t7254?lang=en®ion=TW |
| N-tosyl-L-phenylalaninyl-chloromethylketone (TPCK) | Sigma-Aldrich | T4376 | protease inhibitor http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t4376?lang=en®ion=TW |
| Bio-Rad protein assay dye reagent concentrate | Bio‐Rad | 500-0006 | for protein quantitation http://www.bio-rad.com/en-us/sku/5000006-bio-rad-protein-assay-dye-reagent-concentrate |
| Protein standard (bovine serum albumin) | Sigma-Aldrich | P5619 | a standard protein for Bio-Rad Protein Assay http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/p5619?lang=en®ion=TW |
| DEAE–Sephadex A-25 chloride form | Sigma-Aldrich | A25120 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a25120?lang=en®ion=TW |
| Spectrum/Por dialysis tubing | Spectrum Laboratories | 132720 | with molecular weight cutoff of 14 kDa http://www.spectrumlabs.com/dialysis/RCtubing.html?Pn=132720; |
| Acrodisc® units with Mustang® E membrane | Pall | MSTG25E3 | for endotoxin removal; operated at flow rates ranging from 1 to 4 ml/min http://www.pall.com/main/laboratory/product.page?id=19992 |
| mouse monoclonal antibody MAb 16F4 | N/A | N/A | raised against the purified HP-NAP of H. pylori strain NCTC 11637 as described in Refernce 23; A gift from Drs. Evanthia Galanis and Ianko D. Iankov at Mayo Clinic, USA http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0264410X10017585 |
| HiLoad 16/600 Superdex 200 pg | GE Healthcare Life Sciences | 28989335 | for gel filtration chromatography http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28989335 |
| PlusOne silver staining kit, protein | GE Healthcare Life Sciences | 17-1150-01 | http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/17115001 |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare Life Sciences | 17-1440-02 | for density gradient centrifugation to purify human neutrophils http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences-tw/products/AlternativeProductStructure _16963/17144002 |
| Flat bottom 96-well white plate | Thermo Fisher Scientific Inc | 236108 | http://www.thermoscientific.com/en/product/nunc-f96-microwell-black-white-polystyrene-plate.html |
| Luminol | Sigma-Aldrich | A8511 | protected from light http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a8511?lang=en®ion=TW |
| Expand long template PCR system | Sigma-Aldrich | 11681834001 | source of High Fidelity PCR enzyme mix http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/elongro?lang=en®ion=TW |
| Dpn I | New England Biolabs | R0176S | https://www.neb.com/products/r0176-dpni |
| Xho I | New England Biolabs | R0146S | https://www.neb.com/products/r0146-xhoi |
| E. coli DH5α | Thermo Fisher Scientific Inc | 18265-017 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18265017 |
| Name | Company | Product Number | Comments |
| Equipment | |||
| U-2800 double beam UV/VIS spectrophotometer | Hitachi | N/A | out of market and upgraded to a new model http://hitachi-hta.com/products/life-sciences-chemical-analysis/uvvisible-spectrophotometers |
| EmulsiFlex-C3 high pressure homogenizer | Avestin Inc | C315320 | http://www.avestin.com/English/c3page.html |
| Hitachi Koki himac CP80WX general ultracentrifuge | Hitachi Koki Co | 90106401 | for separation of the soluble and insoluble protein fractions from E. coli lysates http://centrifuges.hitachi-koki.com/products/ultra/cp_wx/cp_wx.html |
| ÄKTA FPLC | GE Healthcare Life Sciences | 18-1900-26 | for gel filtration chromatography http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/18190026 |
| Aviv model 62ADS CD spectrophotometer | Aviv Biomedical | N/A | out of market and upgraded to a new model http://www.avivbiomedical.com/circular.php |
| LAS-3000 imaging system | Fujifilm | N/A | discontinued and replaced http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28955810 |
| Wallac 1420 (Victor2) multilabel counter | Perkin-Elmer | 1420-018 | for chemiluminescence detection http://www.perkinelmer.com/catalog/product/id/1420-018 |
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