This paper describes a method for the measurement of fuel oxidation in Drosophila melanogaster in which trace amounts of specific radiolabeled metabolic substrates are fed to flies. The exhaled radiolabeled CO2 that is a produced from fuel oxidation is collected and measured.
Kraften av Drosophila genetics allt oftare tillämpas på frågor om hormonsignalering och metabolism och till utvecklingen av modeller av human sjukdom i denna organism. Känsliga metoder för mätningar av parametrar såsom metabolic hastigheter behövs för att driva förståelse av fysiologin och sjukdom i små djur, såsom fruktflugan. Den här beskrivna metoden bedömer bränsleoxidering i litet antal av vuxna flugor matas livsmedel som innehåller spårmängder av 14 C-märkt substrat såsom glukos eller fettsyra. Efter utfodringsperioden och eventuella ytterligare experimentella manipulationer, är flugor överförs till korta rör utjämnade med mesh, vilka därefter placeras i glasampuller innehållande KOH-mättade filterpapper att fällorna utandade, radiomärkt CO2 som genereras från oxidation av radiomärkta substrat såsom kaliumbikarbonat, KHCO3. Denna radiomärkta bikarbonat mäts genom scintillationsräkning. Detta är aqVANTITATIV, reproducerbar och enkel metod för studier av bränsle oxidation. Användningen av radiomärkt glukos, fettsyror eller aminosyror kan man bestämma bidraget från dessa olika bränslekällor till energimetabolism under olika förhållanden, såsom utfodring och fasta och i olika genetiska bakgrunder. Detta kompletterar andra metoder som används för att mäta in vivo energiomsättning och bör öka förståelsen av metabolisk reglering.
Arbetet i modellen organismen Drosophila melanogaster har i hög grad bidragit till förståelsen av genetiska principer, utvecklingsprocesser, tillväxt, åldrande, beteende, immunitet och sjukdomar hos människor 1,2. En myriad av genetiska och cellbiologiska metoder i Drosophila har drivit utvecklingen inom dessa områden. Emellertid har studier av metabolism i bananfluga utvecklats långsammare, beror till stor del på svårigheter att mäta metaboliska parametrar på ett sådant litet djur. Intresset för att använda Drosophila som en modell för att studera mänskliga sjukdomar som diabetes och för att förstå de bidrag metabolism till tillväxt och olika sjukdomar har drivit på fältet för att utveckla och anpassa metabola tekniker för denna organism 3,4.
Tillförlitliga metoder finns nu tillgängliga för mätning av ett antal metabola parametrar i bananflugan. Till exempel, är det enkelt att utvärdera födointaget <sdig> 5, nivåer av lagrade triglycerider och glykogen, samt cirkulerande hemolymph nivåer av glukos och den huvudsakliga cirkulerande socker i farten, trehalos, som är en disackarid sammansatt av två molekyler glukos 4. Användning av metabola spårämnen har gjort det möjligt att studera absorptionen av näringsämnen från kosten och omvandlingen av absorberade näringsämnen såsom glukos till lagringsformer glykogen och triglycerider 6. Metabolic hastigheter kan bedömas i bananflugan genom mätning av syreförbrukning 7,8 och koldioxid (CO 2) produktion. Citronsyracykeln oxiderar två-kol enheter som kan komma in i cykeln såsom acetyl coenzym A (CoA), som härrör från metabolismen av kost- och lagrade kolhydrater och fettsyror. Varje varv av cykeln genererar en molekyl vardera av GTP (eller ATP) och elektrondonator FADH2, tre molekyler av NADH och två molekyler av restprodukt CO2. CO 2 produktionen kananvändas för att uppskatta den basala metaboliska hastigheten. Totala CO 2 produktion kan kvantifieras i Drosophila genom användning av kommersiellt tillgängliga eller handgjorda respirometers 9-10,11.
Mätningen av den totala CO2 produktion, särskilt när den kombineras med mätning av O2 förbrukning, ger värdefull insikt i hela kroppen energiomsättningen. Men att denna åtgärd inte identifiera närings oxiderade för adenosintrifosfat (ATP) produktion. Tre huvudklasser av näringsämnen kan gå in i citronsyracykeln efter omvandling till acetyl CoA: kolhydrater, fettsyror och proteiner. Glukos-6-fosfat, som härrör från dietary glukos eller lagras glykogen, kan omvandlas till pyruvat som dekarboxyleras genom pyruvatdehydrogenas för att bilda acetyl CoA. Fördelning av fettsyror som härrör från kosten eller från lagrade triglycerider av ß-oxidation ger acetyl CoA som sedan kommer in i citronsyracykeln. SlutligenEn majoritet av aminosyror kan komma in i citronsyracykeln efter omvandling till pyruvat, acetyl CoA eller citronsyracykeln mellan såsom alfa-ketoglutarat.
Närings specifika bidrag till energimetabolism under basala och stimulerade förhållanden kan övervakas med hjälp av radioaktiva spårämnen. Protokollet som presenteras här är anpassad för användning i Drosophila från ett protokoll som används för att bedöma oxidation i celler odlade i kultur 12,13. I detta tillvägagångssätt, fruktflugor utfodras 14 C-radiomärkt metaboliska substrat (kolhydrater, fettsyror eller aminosyror) i dieten för en kort (timmar) eller långa (dagar) puls, jagade på omärkt mat, och sedan utsätts för en kammare innehållande kaliumhydroxid (KOH) -saturated filterpapper för att fånga utandad CO2 som bikarbonat. Radiomärkt bikarbonat kan kvantifieras genom scintillationsräkning. Skillnader i radiomärkt-CO 2 produktion mellan experimental grupper av flugor kan återspegla användningen av olika bränslen för ATP-produktion under loppet av en längre snabba eller inneboende skillnader i bränslemetabolism mellan genotyper, till exempel.
Detta protokoll beskriver en metod för att mäta oxidation av specifika radiomärkta substrat i vuxen Drosophila melanogaster. Denna teknik är enkel, kvantitativ, reproducerbar och känslig, och det kompletterar existerande metoder som mäter total CO 2 produktion och O 2 konsumtion eftersom det kan användas för att identifiera det näringsämne (n) som oxideras för ATP-produktion.
Mätning av CO 2 frigöras från oxidation av specifika radiomärkta substrat med användning av den metod som beskrivs här är komplementär till tekniker som mäter total CO2 produktion. Totalt CO2 produktion (V CO2) tillåter uppskattning av ämnesomsättning och när totala O2 förbrukning (V O2) är känd, kan ämnesomsättning beräknas och bränslekällan för oxidation kan uppskattas baserat på respiratorisk kvot (V CO2 / V O2 = RER). Närkolhydrater är den exklusiva substratet, RER = 1, men när fettsyror är den enda källan, RER = 0,7, på grund av stökiometrin av reaktionerna av glukos och lipid oxidation. I avsaknad av utrustning för att mäta syreförbrukningen i Drosophila 14, kan den oxidativa bränslekällan inte kan identifieras. Men genom märkning flyger med spårmängder av ett radioaktivt substrat eller annan Mätnings andelen radiomärkt CO2 produktion, kan man dra slutsatser om möjligheten av flugor att oxidera ett givet substrat vid olika tidpunkter under en stimulans eller om effekterna av en given mutation på bränsle oxidation.
Det finns ett antal viktiga steg i detta protokoll. För det första bör man vara försiktig när man använder radioaktiva material för att undvika spill och förorening av forskningsområden. För det andra, när anesthetizing flugor under steg 2.1 och 3.4, bör försöksledaren arbeta snabbt för att undvika effekterna av långvarig CO2exponering på metabolism och beteende. En grupp av 20 flugor kan bedövas och överfördes till en ny ampull eller in i en fluga pod i 20 sek eller mindre. När de överförs från en anestesiapparat till en flaska mat, ska flaskan vilade på sin sida för att förhindra sövda flugor från att fastna på livsmedelsytan. När flugor matas radiomärkt mat under loppet av flera dagar som i steg 2,2, bör försöks försäkra att maten inte torkar ut som flugor är känsliga för uttorkning.
Fed eller fastande före märkning, valet av etiketten, längden märkning tid, hur lång tid i farten pod, och metoden för anestesi är parametrar som kan utsättas för felsökning och modifiering vid användning av denna teknik. Först flugor utsätts för korta märkningsperioder (2-3 tim) är det osannolikt att konsumera betydande mängder radiomärkt mat om utsätts för en fasteperiod på förhand. För det andra, valet av etikett cen effekt slutsatserna man kan dra om metabola fenotyper. Till exempel, radiomärkt CO 2-produktion från D- [1- 14 C] -glukos kan reflektera oxidation genom citronsyracykeln eller pentos fosfat shunt, medan radiomärkt CO 2-produktion från D- [6- 14 C] -glukos återspeglar oxidation genom citronsyracykeln endast 12,15,16. Utfodring flugor med en radiomärkt spårämne för en essentiell aminosyra 17,18 skulle vara en bra strategi för att bedöma oxidation av aminosyror som härrör från proteiner. Slutligen långa märknings perioder med radiomärkt glukos väcker också möjligheten till införlivande av denna prekursor till andra klasser av molekyler såsom triglycerider 19 och aminosyror, såsom alanin, som lätt interconverts med pyruvat. Detta kan bedömas genom att mäta radioaktivitet införlivad i dessa olika klasser av molekyler 6. I själva verket kan olika grupper av flugor matas radiolabeled substrat på samma sätt och sedan används för att flyga pod experiment eller mätning av radiomärkning som lagras och förblir i glykogen och triglycerider i födointag villkor 6, till exempel. En annan strategi är att använda kort märkning perioder som sannolikt kommer att avslöja oxidation av radioaktivt märkta näringsämnen i kosten själva och inte lagrings former av dessa näringsämnen. För det tredje är det även möjligt att två grupper av flugor kunde ha identiska hastigheter av 14 CO 2 produktionen under en viss tid, men mycket olika hastigheter från början. Därför kan variera mängden tid som flyger spendera i flugan pod vara en viktig parameter för att förändra vid bedömningen fenotypisk variation. Slutligen uppmanar detta protokoll för användning av en kort period av CO 2 bedövning när sätter flugor i farten pod apparaten. Det är möjligt att CO 2 anestesi kan påverka metabolisk funktion under loppet av flugan pod experimentet. Ett alternativt enILLVÄGAGÅNGSSÄTT är att använda kväve narkos som inte påverkar ämnesomsättning 20.
Som med vilken som helst teknik som mäter ett sådant komplext system som bränsle oxidation och ämnesomsättning, den här beskrivna metoden har begränsningar. För det första är det möjligt att flugor i olika grupper kan konsumerar olika mängder av radiomärkt mat och skulle sålunda komma in i CO 2 uppsamlingsfasen av analysen med olika utgångsmängder av substrat. Detta kan styras för att i viss mån genom att utföra experiment med stora provstorlekar och genom att mata flugor en masse. För korta märkningsperioder, flugor med liknande blåfärgade tarmar kommer ha utfodrats med radiomärkning och kan överföras till jakten delen av experimentet. Mängden radiomarkör som finns kvar i en grupp av flugor kan också mätas vid slutet av experimentet och i separata grupper av flugor efter slutet av utfodring och initiala chase period. För det andra aktivitetsnivå mellangrupper av flugor i gylfen skida kan variera. Detta måste bestämmas experimentellt och beaktas vid tolkning av data. För det tredje innebär denna teknik inte mäta den totala CO2 produktion, bara produktionen av en viss diet näringsämne eller lagringsformen (s) av detta näringsämne. Detta protokoll är inte en ersättning för utan är ett komplement till mätningar av VCO 2 eftersom det ger olika och ytterligare information.
Den här beskrivna metoden åtgärder som utandas, radiomärkt CO 2 som är en produkt av oxidation av spårmängder av specifika metaboliska substrat. Genom att variera den använda märkningen – glukos, fettsyra eller aminosyra – en kan utforma alltmer sofistikerade experiment för att bedöma bidragen från olika substrat till metabolism under olika fysiologiska betingelser, såsom svält och på olika genetiska bakgrunder. Framtida tillämpningar av denna teknik innefattar mätning av metabolism larv och PUPP utvecklingsstadier, två stadier av Drosophila livscykel som kännetecknas av extrema närings lagring och nedbrytning, respektive.
The authors have nothing to disclose.
The author thanks Drs. Mingjian Lu and Morris Birnbaum for helpful advice and funding support from NIDDK (R21DK089391).
PALMITIC ACID, [1-14C]-, 50 µCi | PerkinElmer | NEC075H050UC | |
GLUCOSE, D-[6-14C]-, 50µCi | PerkinElmer | NEC045X050UC | |
Glucose, D-[1-14C]-, 50µCi | PerkinElmer | NEC043X050UC | |
Drosophila Vials, Narrow, Polystyrene | Genesee Scientific | 32-116 | |
Round-Bottom Polypropylene Tubes, 12X75 mm | Fisher Scientific | 14-959AA | |
Mesh, nitex nylon, 120 µm | Genesee Scientific | 57-102 | |
20ml borosilicate glass scintillation vials | Fisher Scientific | 03-337-15 | |
Flask top stopper with off-center hole | Fisher Scientific | K882310-0000 | |
Polypropylene center well | Fisher Scientific | K882320-0000 | |
Whatman GF/B glass microfiber filter paper, circle, 2.1cm diameter | 09-874-20 | ||
Ecoscint A | National Diagnostics | LS-273 | |
6ml Scintillation Vials with Push-On/Twist-Off Caps | National Diagnostics | SVC-06 |