This paper describes a method for the measurement of fuel oxidation in Drosophila melanogaster in which trace amounts of specific radiolabeled metabolic substrates are fed to flies. The exhaled radiolabeled CO2 that is a produced from fuel oxidation is collected and measured.
果蝇遗传学的电源被越来越多地应用到激素信号和代谢的问题,并在对人类疾病模型在该生物体的发展。需要如代谢率的参数测量敏感的方法,以推动小动物生理和疾病的认识,例如果蝇。此处所描述的方法评估的燃料氧化饲喂含14 C标记的底物如葡萄糖或脂肪酸痕量食品成蝇小的数字。馈送周期以及任何其他实验操作后,蝇转移至网眼封短管,然后将其放置在含有KOH饱和滤纸的玻璃小瓶该陷阱呼出,从放射性标记的底物如碳酸氢钾的氧化产生的放射性标记的 CO 2, KHCO 3。此放射性标记的碳酸氢盐是通过闪烁计数来测量。这是AQ燃料氧化研究uantitative,重复性好,简单的方法。使用放射性标记的葡萄糖,脂肪酸,或氨基酸的允许这些不同的燃料源到能量代谢不同的条件,如进料和禁食和在不同的遗传背景下作出的贡献的判定。这补充用于体内能量代谢以测量其他方法和应进一步代谢调节的理解。
在模式生物果蝇的工作已经到遗传原理,发展过程,成长,衰老,行为,免疫和人类疾病1,2的理解作出了巨大贡献。在果蝇遗传学和细胞生物学方法一无数在这些领域带动发展。然而,新陈代谢在果蝇的研究已经发展较为缓慢,在很大程度上是由于在测量这样的小动物代谢参数的困难。在使用果蝇作为研究人类疾病如糖尿病的模型和对于理解代谢的增长和各种病症的捐款的兴趣已经被推领域开发和适应代谢技术这种微生物3,4。
可靠的方法现已为多家在果蝇代谢参数的测量。例如,它是简单的评估食物摄取<s向上> 5,存储甘油三酯和糖原,以及葡萄糖的循环血淋巴水平和在飞,海藻糖,这是一个葡萄糖4的两分子组成的双糖的主要循环糖水平。代谢示踪剂的使用使从饮食和吸收的营养的转化营养吸收的研究如葡萄糖到存储形式的糖原和甘油三酯6。代谢率可以在水果通过氧消 耗7,8和二氧化碳的测量飞行(CO 2)的生产来评估。三羧酸循环氧化二碳单位,可以进入循环为乙酰辅酶A(辅酶A),它是从饮食和存储碳水化合物和脂肪酸的代谢而得。该循环的每个依次产生每个GTP(或ATP)的一个分子和电子给体FADH 2,NADH的三分子,和废产物的 CO 2的两个分子。 CO 2的产能被用于估计的基础代谢率。总的二氧化碳生产可以在果蝇通过使用市售的或手工呼吸计9-10,11的量化。
总的 CO 2生产的测定中,特别是当与O 2的消耗测量耦合,提供了有价值的洞察全身能量代谢。然而,这一措施不标识养分被氧化为三磷酸腺苷(ATP)的生产。营养素的三大类可以进入三羧酸循环以下转化为乙酰辅酶A:碳水化合物,脂肪酸,和蛋白。葡萄糖-6-磷酸,从膳食葡萄糖或储存的糖原衍生,可以转换到由丙酮酸脱氢酶脱羧以形成乙酰CoA丙酮酸盐。通过β-氧化收率乙酰CoA该再进入三羧酸循环从饮食或从存储的甘油三酯的脂肪酸击穿。最后上,大多数氨基酸可进入三羧酸循环以下转化为丙酮酸,乙酰辅酶A或三羧酸循环的中间产物如α-酮戊二酸。
基底和刺激条件期间能量代谢特定营养贡献可以通过使用放射性示踪剂的进行监测。这里介绍的协议适于在果蝇使用从用于评估在培养12,13生长的细胞氧化的协议。在这种方法中,果蝇是在饮食很短的时间(小时)馈14 C-放射性标记的代谢底物(碳水化合物,脂肪酸,或氨基酸)或长(天)脉冲,追赶上未标记食品,然后暴露于包含氢氧化钾(KOH) -饱和滤纸用于捕集呼出的CO 2的碳酸氢钠室中。放射性标记的碳酸氢盐可以通过闪烁计数进行定量。在实验的放射性-CO 2的生产差异苍蝇的人团可以反映使用不同的燃料的对ATP产量超过在燃料代谢基因型之间延长的快速或固有的差别的过程中,例如。
这个协议描述了测量在成年果蝇特定放射性标记底物的氧化的方法。这种技术是直接的,定量的,可再现的和敏感的,并且它补充了测量总的 CO 2生产和O 2消耗,因为它可被用来识别被氧化为ATP产生的养分(多个)的现有方法。
使用这里描述的方法的特定的放射性标记底物的氧化释放的CO 2的测量是该测量总的 CO 2的生产技术是互补的。总的 CO 2生产(ⅤCO 2)允许代谢率的估计,并且当总的 O 2消耗(V 02)是已知的,代谢率可以计算和用于氧化燃料源可以基于所述呼吸交换率估计(Ⅴ CO2 / V O2 = RER)。什么时候碳水化合物是独占的衬底,RER = 1,但是,当脂肪酸是异源,RER = 0.7,由于葡萄糖和脂质氧化的反应的化学计量。在没有设备来测量在果蝇 14氧消耗,氧化燃料源不能被识别。然而,通过标记与一种放射性底物或另一种痕量和放射性标记的CO 2的生产的测量速率苍蝇,人们可以得出关于苍蝇的刺激过程中或约的效果以氧化在不同时间点的给定基底的能力的结论鉴于燃油氧化突变。
有许多在该协议的关键步骤。首先,应注意使用放射性物质,以避免泄漏和研究领域的污染作出。二,麻醉过程中的步骤2.1和3.4苍蝇时,实验者应迅速工作,以避免长时间的 CO 2的效果曝光的代谢和行为。 A组20苍蝇可麻醉并转移至新的小瓶或到20秒或更小的飞吊舱。当从麻醉设备转移到食物小瓶中,小瓶应当在其一侧被休息以防止麻醉蝇从卡住对食品的表面上。当苍蝇在数天的过程中馈放射性标记食品如在步骤2.2中,实验者应确保该食品不干透苍蝇是脱水敏感。
进食或禁食状态之前标签,标签的选择,标记的时间长度,时间在飞荚长度,和麻醉的方法是可以使用这种技术时,可以进行故障诊断和修正参数。首先,苍蝇经过短标签周期(2 – 3小时)不太可能,除非经受禁食期间提前消费的食品放射量显著。第二,标记C的选择有影响的结论之一就是能够得出代谢表型。例如,从D-放射性标记的CO 2的生产[1- 14 C]葡萄糖能反映通过柠檬酸循环或戊糖磷酸分流氧化,而 从D-放射性标记的 CO 2的生产[6- 14 C]葡萄糖反映氧化通过三羧酸循环只有12,15,16。馈送带放射性标记的示踪物的苍蝇为一种必需氨基酸17,18将是评估从蛋白质衍生的氨基酸氧化的好策略。最后,用放射性标记的葡萄糖冗长标记周期也提高到其它类分子,如甘油三酯19和氨基酸,如丙氨酸,易于与丙酮酸interconverts该前体中掺入的可能性。这可通过测量放射性掺入这些不同类分子6的进行评估。事实上,苍蝇独立的同伙可以喂拉德以相同的方式iolabeled基底,然后用于存储和在馈保持在糖原和甘油三酯和禁食条件6,例如苍蝇荚果实验或放射性标记的测量。另一个策略是使用有可能揭示本身放射性标记的膳食的营养成分的氧化和这些营养素不存储形式的短标记周期。第三,它也有可能是蝇两组可具有14 CO 2的产量超过给定的时间量的相同速率,但很不同的速率最初。因此,不同的时间是拥有在飞荚花费的金额可以是评估表型变异时改变的重要参数。最后,该协议要求使用二氧化碳麻醉苍蝇把成飞荚设备时短时间的。这是可能的CO 2的麻醉可能影响代谢功能在飞荚实验过程。另一种一接近角是使用氮麻醉不影响代谢速率20。
与测量这样一个复杂的系统,燃料的氧化和代谢速率的任何技术,这里所描述的方法具有局限性。首先,它可能是在不同的组可以消耗不同量的放射性标记的食品苍蝇,这将与衬底的不同起始量进入该测定的CO 2的收集阶段。这可以通过执行与大样本实验和饲养苍蝇成群加以控制在一定程度。短标签时期,过得有类似蓝色的胆量都将消耗的放射性标记,可以结转到实验的追逐部分。剩余的一组蝇中的放射性标记的量也可以在实验结束时,并在进料和初始追逐期间结束后的苍蝇单独队列测量。第二,之间的活动水平在飞豆荚苍蝇基团可以不同。这将必须通过实验来确定,并解释数据时加以考虑。第三,该技术不测量总CO 2的生产,只是从一个特定的食物营养或营养的存储形式(多个)的生产。这个协议是不进行更换,而是对VCO 2的测量互补,因为它提供了不同的和额外的信息。
这里所描述的方法测量呼出,放射性标记的 CO 2是特定的代谢底物的痕量的氧化的产物。通过改变所用的标记 – 葡萄糖,脂肪酸,或氨基酸 – 可以设计越来越复杂的实验,以评估不同的基材的代谢不同的生理条件如饥饿和在不同的遗传背景下做出的贡献。这种技术的未来应用包括metabolis测量米发展的幼虫和蛹的阶段, 果蝇的生命周期为特征的营养分别储存和分解,极端的两个阶段。
The authors have nothing to disclose.
The author thanks Drs. Mingjian Lu and Morris Birnbaum for helpful advice and funding support from NIDDK (R21DK089391).
PALMITIC ACID, [1-14C]-, 50 µCi | PerkinElmer | NEC075H050UC | |
GLUCOSE, D-[6-14C]-, 50µCi | PerkinElmer | NEC045X050UC | |
Glucose, D-[1-14C]-, 50µCi | PerkinElmer | NEC043X050UC | |
Drosophila Vials, Narrow, Polystyrene | Genesee Scientific | 32-116 | |
Round-Bottom Polypropylene Tubes, 12X75 mm | Fisher Scientific | 14-959AA | |
Mesh, nitex nylon, 120 µm | Genesee Scientific | 57-102 | |
20ml borosilicate glass scintillation vials | Fisher Scientific | 03-337-15 | |
Flask top stopper with off-center hole | Fisher Scientific | K882310-0000 | |
Polypropylene center well | Fisher Scientific | K882320-0000 | |
Whatman GF/B glass microfiber filter paper, circle, 2.1cm diameter | 09-874-20 | ||
Ecoscint A | National Diagnostics | LS-273 | |
6ml Scintillation Vials with Push-On/Twist-Off Caps | National Diagnostics | SVC-06 |