Microinjection pour transgénèse et Génome Édition dans Épinoche à trois épinoches
Summary
Manipulations transgéniques et l' édition du génome sont essentielles pour tester fonctionnellement le rôle des gènes et des éléments cis -Informations règlementaires. Voici un protocole de microinjection détaillé pour la génération de modifications génomiques (y compris les constructions fluorescentes Tol2 médiées reporters transgène, TALENs et CRISPRs) est présenté pour le poisson modèle émergent, l'épinoche à trois épines.
Abstract
Le poisson épinoche à trois épines a émergé comme un système puissant pour étudier la base génétique d'une grande variété de morphologiques, physiologiques et phénotypes comportementaux. Les remarquablement divers phénotypes qui ont évolué comme des populations marines adapter à d'innombrables milieux d'eau douce, combinée avec la capacité de traverser les formes marines et d'eau douce, fournissent un système de vertébrés rares dans lesquels la génétique peuvent être utilisés pour cartographier les régions génomiques contrôlant des traits évolué. Excellentes ressources génomiques sont maintenant disponibles, ce qui facilite la dissection génétique moléculaire de changements évolués. Bien que des expériences de cartographie génèrent des listes de gènes candidats intéressants, les manipulations génétiques fonctionnels sont nécessaires pour tester le rôle de ces gènes. La régulation des gènes peut être étudiée avec des plasmides et des taux d'alcoolémie reporteurs transgénique intégré dans le génome en utilisant le système de transposase Tol2. Fonctions de gènes candidats spécifiques et des éléments cis -Informations règlementaires peuvent être évalués en induisant cibléemutations avec Talen et CRISPR / cas9 réactifs de modification du génome. Toutes les méthodes nécessitent l'introduction d'acides nucléiques dans fécondés embryons d'épinoches une cellule, une tâche rendue difficile par le chorion épais d'embryons d'épinoches et relativement petit et mince blastomère. Ici, un protocole détaillé pour la microinjection d'acides nucléiques dans des embryons d'épinoches est décrit pour transgéniques et d'édition du génome applications pour étudier l'expression et la fonction des gènes, ainsi que des techniques pour évaluer le succès de la transgénèse et de récupérer des lignées stables.
Introduction
Un élément fondamental de comprendre comment la biodiversité se pose est de déterminer les bases génétiques et de développement des changements phénotypiques ont évolué dans la nature. Le poisson épinoche à trois épines, Gasterosteus aculeatus, a émergé comme un excellent modèle pour l' étude de la base génétique de l' évolution. Épinoches ont subi de nombreux changements évolutifs adaptatifs que les poissons marins ont colonisé d' innombrables milieux d'eau douce autour de l'hémisphère nord, ce qui entraîne morphologique dramatique, physiologique, et les changements de comportement 1. Les génomes des individus de vingt- et -un des populations d'épinoches ont été séquencés et assemblés, et une carte de liaison à haute densité a été générée pour améliorer encore l'ensemble 2,3. Expériences de cartographie génétique ont identifié des régions génomiques sous – jacente phénotypes évolué 4-6, et dans quelques cas, les rôles fonctionnels des gènes candidats spécifiques ont été testés 7,8. Un certain nombre de régions génomiques sous – jacentes des changements morphologiques ont été identifiés avec des gènes candidats prometteurs, mais ces candidats n'a pas encore été testé fonctionnellement 9-12. En outre, les épinoches sont des modèles communs pour les études de génétique des populations / génomique 13,14, spéciation 15, le comportement 1, l' endocrinologie 16, écotoxicologie 17, de l' immunologie 18 et parasitologie 19. Les études futures dans chacun de ces domaines bénéficieront de la capacité à effectuer des manipulations génétiques fonctionnels épinoches. En plus de la manipulation de leurs séquences codantes, les rôles des gènes candidats peuvent être évaluées par l' étude de leurs séquences cis -Informations règlementaires et fonctionnellement en augmentant, diminuant ou en éliminant l' expression du gène candidat. Microinjection et transgénèse méthodes épinoches sont bien établies 7,8,20 et ont d' abord été développés en utilisant une méganucléase à médiationméthode 21 décrite en medaka 22. La méthode de microinjection modifiée présentée ici a été optimisé pour les deux transgénèse Tol2 médiée et récemment mis au point des réactifs de modification du génome, y compris TALENs et CRISPRs.
Les modifications apportées aux éléments de cis sont considérés comme essentiels à l' évolution morphologique, comme les changements de cis peuvent éviter les conséquences pléiotropiques négatifs des mutations 23 codage. Par conséquent, le test et la comparaison des séquences cis putatifs -Informations règlementaires est devenu un objectif central d'un nombre croissant d'études sur l' évolution. En outre, la plupart des variantes de maladies humaines sont des variantes réglementaires 24,25, et des systèmes modèles de vertébrés sont cruellement nécessaires pour étudier la fonction de l' élément cis et logique règlementaires. Les poissons qui fertiliser leurs embryons à l' extérieur dans un grand nombre offrent des systèmes de vertébrés puissants pour étudier cis – régulation. Le système de transposon Tol2, dans lequel étranADN gn être intégré dans le génome est flanqué de Tol2 transposase sites et liaison co-injecté avec Tol2 transposase ARNm, fonctionne avec une grande efficacité pour intégrer avec succès le plasmide construit dans les génomes de poisson 26 – 28. En règle générale, un activateur potentiel est cloné en amont d'un promoteur de base (tels que hsp70l 29) et le gène rapporteur fluorescent tel que EGFP (protéine fluorescente verte améliorée) ou mCherry dans un squelette Tol2 et injecté avec transposase ARNm 26. Observation d'expression du rapporteur fluorescent, soit dans des embryons ou des enfants avec des transgènes intégrés de manière stable injecté, fournit des informations sur la régulation spatio-temporelle de l'expression génique entraînée par l'activateur putatif. Dans d'autres expériences, des amplificateurs validés peuvent être utilisés pour entraîner une surexpression spécifique du tissu de gènes d'intérêt.
Pour l' analyse des régions plus grandes cis -Informations règlementaires, de haute qualité à grande insert genombibliothèques ic utilisant chromosomes bactériens artificiels (BAC) ont été construits pour les deux marins et d' eau douce épinoches 30. Ces taux d' alcoolémie peuvent être recombineered pour remplacer un gène avec un gène rapporteur fluorescent dans le contexte d'un grand (150-200 kb) 31 région génomique. Le rapporteur fluorescent est ensuite exprimé dans un modèle spatio-temporelle tel que déterminé par des séquences régulatrices au sein du BAC. Pour les études dans les poissons, les sites Tol2 peuvent être ajoutés à la BAC pour faciliter l' intégration génomique 32,33. Dans les stades ultérieurs du développement , lorsque l' hybridation in situ est techniquement difficile, l'affichage fluorescent de BAC peut être utilisé pour étudier les profils d'expression des gènes, comme cela a été montré pour épinoche protéines morphogénétiques osseuses 6 (BMP6) 20. En outre, les modèles d'expression fluorescents dans un individu peuvent être suivis au fil du temps, qui ne peut être accompli avec l' hybridation in situ. Un TA peut également être utilisé pour ajouter un additional copie d'une région génomique pour augmenter la posologie d'un gène d'intérêt.
Pour l'étude de la fonction des gènes, l' édition du génome est un domaine en expansion explosive qui peut être utilisé pour produire des modifications ciblées à des séquences génomiques dans une grande variété d'organismes 34. Transcription nucléases effectrices activatrices-like (Talens) sont, nucléases spécifiques de séquence modulaires initialement isolées à partir d' agents pathogènes des plantes qui peuvent être conçus avec précision pour se lier directement à une séquence génomique de choix et de générer un double brin casser 35,36. Cluster régulièrement intercalées répétitions palindromiques courtes (CRISPR) / systèmes CAS ont été initialement trouvés dans les bactéries et utilisent un ARN guide et la protéine cas9 pour générer une pause dans une séquence d'ADN cible complémentaire au guide 37. La réparation ultérieure de la double rupture du brin créé par les deux TALENs et CRISPRs laisse souvent derrière une petite insertion ou la suppression, ce qui peut perturber la fonction de la séquence cible35-37. En épinoches, TALENs ont été utilisés pour perturber l' expression des gènes en ciblant un activateur de 20, et les deux TALENs et CRISPRs ont réussi à produire des mutations dans des séquences (données non publiées) de codage. Un protocole détaillé pour la génération de CRISPRs pour une utilisation chez le poisson zèbre peut être utilisé comme guide pour développer CRISPRs pour épinoches 38.
Et des expériences transgéniques génome de montage nécessitent l'introduction d'acides nucléiques dans un embryon d'une des cellules nouvellement fécondé. En introduisant l'outil de transgène ou le génome d'édition au début du développement, le nombre de cellules filles génétiquement modifiées dans l'embryon est maximisée. embryons injectés sont ensuite visuellement criblés pour fluorescence ou moléculairement criblées pour des modifications du génome. Si les cellules qui contribuent à la lignée germinale sont ciblés avec succès, le transgène ou la mutation peuvent être transmises à un sous-ensemble de la progéniture, même lorsque la létalité post-injection est élevée. Les poissons de mosaïque peuvent être ou par croisemententrecroisés et leur progéniture tamisé pour récupérer les allèles mutants ou un transgène intégré de manière stable d'intérêt. Ce protocole décrit les méthodes pour introduire des transgènes et des réactifs de modification du génome dans des embryons d'épinoches une cellule et le suivi des modifications génomiques réussies.
Protocol
Representative Results
Discussion
Injecter une cellule embryons d'épinoches pour la transgénèse ou l'édition du génome présente trois principaux défis. Tout d'abord, par rapport à des embryons de poisson zèbre, l'épinoche embryonnaire chorion est difficile et souvent casser les aiguilles. Ce problème peut être partiellement résolu en utilisant plus épais et plus forts micropipettes de verre et d' injection perpendiculaire au chorion (voir Protocole, Figure 2). Veiller à ce que le moins d'eau possib…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été financé en partie par le NIH R01 # DE021475 (CTM), une formation prédoctorale Grant 5T32GM007127 NIH (PAE), et une Graduate Research Fellowship NSF (NAE). Nous remercions Kevin Schwalbach pour effectuer BAC recombineering et les injections, Nick Donde pour générer des données de séquençage Sanger CRISPR et Katherine Lipari des commentaires utiles sur le protocole d'injection.
Materials
| Stereomicroscope with transillumination | Leica | S6e/ KL300 LED | |
| Manual micromanipulator | Applied Scientific Instrumentation | MM33 | Marzhauser M33 Micromanipulator |
| Pressure Injecion system | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 | |
| Back pressure unit | Applied Scientific Instrumentation | BPU | |
| Micropipette holder kit | Applied Scientific Instrumentation | MPIP | |
| Magnetic base holder | Applied Scientific Instrumentation | Magnetic base | |
| Foot switch | Applied Scientific Instrumentation | FSW | |
| Iron plate (magnetic base) | Narishige | IP | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Disposable transfer pipettes | Fisher | 13-711-7M | |
| 0.5% phenol red in DPBS | Sigma | P0290 | injection tracer |
| #5 forceps, biologie dumoxel | Fine Science Tools | 11252-30 | for needle breaking |
| Micropipette Storage Jar | World Precision Instruments | E210 | holds needles |
| 6", 6 teeth per inch plaster drywall saw | Lenox | 20571 (S636RP) | hold eggs for injection |
| 13 cm x 13 cm glass plate | any hardware store | – | |
| Borosilicate glass capillaries, 1.0 mm OD/0.58 mm ID | World Precision Instruments | 1B100-F4 | *harder glass than zebrafish injection capillaries |
| 150 x 15mm petri dish | Fisher | FB0875714 | raise stickleback embryos |
| 35 x 10mm petri dish | Fisher | 08-757-100A | store eggs pre-injection |
| Instant Ocean Salt | Instant Ocean | SS15-10 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761-500G | |
| Tricaine methanesulfonate/MS-222 | Western Chemical Inc | MS222 | fish anaesthesia/euthanasia |
| Sp6 transcription kit | Ambion | AM1340 | For transcription of TALENs and transposase mRNA |
| RNeasy cleanup kit | Qiagen | 74104 | purify transposase or TALEN RNA |
| QiaQuick PCR cleanup kit | Qiagen | 28104 | clean up plasmids for injection |
| Proteinase K 20 mg/ml | Ambion | AM2546 | for DNA preparation |
| Nucleobond BAC 100 kit | Clontech | 740579 | for BAC DNA preparation |
| NotI | NEB | R0189L | |
| Phusion polymerase | Fisher | F-530L | |
| Qiagen PlasmidPlus Midi kit | Qiagen | 12943 | contains endotoxin rinse buffer |
| QIAQuick Gel Extraction | Qiagen | 28704 | for sequencing induced mutations |
| Phenol:chloroform:Isoamyl alcohol | Sigma | P2069-100ML | |
| Sodium acetate | Sigma | S2889-250G | |
| Ethanol (molecular biology grade) | Sigma | E7023-500ML | |
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| 50X Tris-acetate-EDTA buffer | ThermoFisher | B49 | |
| 0.5-10KbRNA ladder | ThermoFisher | 15623-200 | |
| Nanodrop Spectrophotometer | Thermo Scientific | Nanodrop 2000 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127-500G | |
| 10X PBS | ThermoFisher | 70011-044 | |
| 1kb Plus DNA Ladder | ThermoFisher | 10787-018 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P9541-500G | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M8266-100G | |
| NP-40 | ThermoFisher | 28324 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379-500ML | |
| Tris pH 8.3 | Teknova | T1083 | |
| 12-strip PCR tube | Thermo Scientific | AB-1113 |
Riferimenti
- Bell, M. A., Foster, S. A. . The Evolutionary Biology of the Threespine Stickleback. , (1994).
- Jones, F. C., et al. The genomic basis of adaptive evolution in threespine sticklebacks. Nature. 484 (7392), 55-61 (2012).
- Glazer, A. M., Killingbeck, E. E., Mitros, T., Rokhsar, D. S., Miller, C. T. Genome assembly improvement and mapping convergently evolved skeletal traits in sticklebacks with Genotyping-by-Sequencing. G3. 5 (7), 1463-1472 (2015).
- Miller, C. T., et al. Modular skeletal evolution in sticklebacks is controlled by additive and clustered quantitative trait Loci. Genetica. 197 (1), 405-420 (2014).
- Shapiro, M. D., et al. Genetic and developmental basis of evolutionary pelvic reduction in threespine sticklebacks. Nature. 428 (6984), 717-723 (2004).
- Colosimo, P. F., et al. Widespread parallel evolution in sticklebacks by repeated fixation of Ectodysplasin alleles. Science. 307 (5717), 1928-1933 (2005).
- Chan, Y. F., et al. Adaptive evolution of pelvic reduction in sticklebacks by recurrent deletion of a Pitx1 enhancer. Science. 327 (5963), 302-305 (2010).
- O’Brown, N. M., Summers, B. R., Jones, F. C., Brady, S. D., Kingsley, D. M. A recurrent regulatory change underlying altered expression and Wnt response of the stickleback armor plates gene EDA. eLife. , e05290 (2015).
- Cleves, P. A., et al. Evolved tooth gain in sticklebacks is associated with a cis-regulatory allele of Bmp6. Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (38), 13912-13917 (2014).
- Erickson, P. A., Glazer, A. M., Cleves, P. A., Smith, A. S., Miller, C. T. Two developmentally temporal quantitative trait loci underlie convergent evolution of increased branchial bone length in sticklebacks. Proc. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 281 (1788), 20140822 (2014).
- Glazer, A. M., Cleves, P. A., Erickson, P. A., Lam, A. Y., Miller, C. T. Parallel developmental genetic features underlie stickleback gill raker evolution. EvoDevo. 5 (1), (2014).
- Ellis, N. A., et al. Distinct developmental and genetic mechanisms underlie convergently evolved tooth gain in sticklebacks. Development. 142, 2442-2451 (2015).
- Hohenlohe, P. A., Bassham, S., Currey, M., Cresko, W. A. Extensive linkage disequilibrium and parallel adaptive divergence across threespine stickleback genomes. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 367 (1587), 395-408 (2012).
- Hohenlohe, P. A., et al. Population genomics of parallel adaptation in threespine stickleback using sequenced RAD tags. PLoS Genet. 6 (2), e1000862 (2010).
- McKinnon, J. S., Rundle, H. D. Speciation in nature: the threespine stickleback model systems. Trends Ecol. Evol. 17 (10), 480-488 (2002).
- Shao, Y. T., et al. Androgen feedback effects on LH and FSH, and photoperiodic control of reproduction in male three-spined sticklebacks, Gasterosteus aculeatus. Gen. Comp. Endocrinol. 182, 16-23 (2013).
- Katsiadaki, I., et al. Three-spined stickleback: an emerging model in environmental endocrine disruption. Environ. Sci. Int. J. Environ. Physiol. Toxicol. 14 (5), 263-283 (2007).
- Lenz, T. L., Eizaguirre, C., Rotter, B., Kalbe, M., Milinski, M. Exploring local immunological adaptation of two stickleback ecotypes by experimental infection and transcriptome-wide digital gene expression analysis. Mol. Ecol. 22 (3), 774-786 (2013).
- Barber, I. Sticklebacks as model hosts in ecological and evolutionary parasitology. Trends Parasitol. 29 (11), 556-566 (2013).
- Erickson, P. A., et al. A 190 base pair, TGF-β responsive tooth and fin enhancer is required for stickleback Bmp6 expression. Dev. Biol. 401 (2), 310-323 (2015).
- Hosemann, K. E., Colosimo, P. F., Summers, B. R., Kingsley, D. M. A simple and efficient microinjection protocol for making transgenic sticklebacks. Behaviour. 141 (11/12), 1345-1355 (2004).
- Thermes, V., et al. I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish. Mech. Dev. 118 (1-2), 91-98 (2002).
- Carroll, S. B. Evo-Devo and an expanding evolutionary synthesis: a genetic theory of morphological evolution. Cell. 134 (1), 25-36 (2008).
- Maurano, M. T., et al. Systematic localization of common disease-associated variation in regulatory DNA. Science. 337 (6099), 1190-1195 (2012).
- Hindorff, L. A., et al. Potential etiologic and functional implications of genome-wide association loci for human diseases and traits. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (23), 9362-9367 (2009).
- Fisher, S., et al. Evaluating the biological relevance of putative enhancers using Tol2 transposon-mediated transgenesis in zebrafish. Nat. Protoc. 1 (3), 1297-1305 (2006).
- Kawakami, K., Shima, A., Kawakami, N. Identification of a functional transposase of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish, and its transposition in the zebrafish germ lineage. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (21), 11403-11408 (2000).
- Kikuta, H., Kawakami, K. Transient and stable transgenesis using Tol2 transposon vectors. Methods in Moleculario Biology: Zebrafish. , 69-84 (2009).
- Halloran, M. C., et al. Laser-induced gene expression in specific cells of transgenic zebrafish. Dev. Camb. Engl. 127 (9), 1953-1960 (2000).
- Kingsley, D. M., et al. New genomic tools for molecular studies of evolutionary change in threespine sticklebacks. Behaviour. 141 (11/12), 1331-1344 (2004).
- Mortlock, D. P., Guenther, C., Kingsley, D. M. A general approach for identifying distant regulatory elements applied to the Gdf6 gene. Genome Res. 13 (9), 2069-2081 (2003).
- Suster, M. L., Abe, G., Schouw, A., Kawakami, K. Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish. Nat. Protoc. 6 (12), 1998-2021 (2011).
- Suster, M. L., Sumiyama, K., Kawakami, K. Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish and mice. BMC Genomics. 10 (1), 477 (2009).
- Kim, H., Kim, J. S. A guide to genome engineering with programmable nucleases. Nat. Rev. Genet. 15 (5), 321-334 (2014).
- Cermak, T., et al. Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting. Nucleic Acids Res. 39 (17), (2011).
- Miller, J. C., et al. A TALE nuclease architecture for efficient genome editing. Nat. Biotechnol. 29 (2), 143-148 (2011).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Talbot, J. C., Amacher, S. L. A streamlined CRISPR pipeline to reliably generate zebrafish frameshifting alleles. Zebrafish. 11 (6), 583-585 (2014).
- Kawakami, K., et al. A Transposon-Mediated Gene Trap Approach Identifies Developmentally Regulated Genes in Zebrafish. Dev. Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
- Green, M. R., Sambrook, J. . Molecular cloning a laboratory manual. , (2012).
- Villefranc, J. A., Amigo, J., Lawson, N. D. Gateway compatible vectors for analysis of gene function in the zebrafish. Dev. Dyn. 236 (11), 3077-3087 (2007).
- Doyle, E. L., et al. TAL Effector-Nucleotide Targeter (TALE-NT) 2.0: tools for TAL effector design and target prediction. Nucleic Acids Res. 40 (W1), W117-W122 (2012).
- Untergasser, A., et al. Primer3-new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Res. 40 (15), e115 (2012).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio) . , (2007).
- Dale, R. M., Topczewski, J. Identification of an evolutionarily conserved regulatory element of the zebrafish col2a1a. Dev. Biol. 357 (2), 518-531 (2011).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat. Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Qi, L. S., et al. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of Gene expression. Cell. 152 (5), 1173-1183 (2013).
