クライオ走査電子顕微鏡により凍結破砕葉組織内の光合成膜の超分子組織を学びます
Summary
Here we describe a procedure for studying freeze-fractured plant tissues. High-pressure frozen leaf samples are freeze-fractured and double-layer coated, yielding well preserved frozen-hydrated samples that are imaged using the cryo-scanning electron microscope at high magnifications with minimal beam damage.
Abstract
凍結破砕サンプルのクライオ走査電子顕微鏡（SEM）は近く、ネイティブ条件での生物学的構造の調査を可能にします。ここでは、葉試料内の光合成（チラコイド）膜の超分子組織を研究するための技術について説明します。これは、高圧葉組織の凍結、凍結破砕、二層コーティングし、最終的にクライオSEM画像によって達成されます。二層コーティング法の使用は、凍結、水和サンプルならびに最小充電効果に最小ビーム損傷に高倍率（> 100,000）の画像を取得することができます。記載された手順を用いて、我々はその場で、復活の植物Craterostigmaのpumilumの脱水中に行わ光化学と光捕集アンテナタンパク質複合体の超分子分布の変化を調べました。
Introduction
酸素発生型光合成、古代のシアノバクテリアに起因するが、葉緑体の細胞小器官の開発につながっ内共生イベントによって藻類や陸上植物に継承されました。すべての現代の酸素発生光栄養生物では、光合成電子伝達とプロトン起動力と還元力の発生が「チラコイド」膜と呼ばれる平坦化嚢様小胞内に行われています。これらの膜は、光合成の光駆動反応を行い、エネルギー変換のための媒体を提供するタンパク質複合体を収容します。植物や（一部）の藻類のチラコイド膜は、2つの別個の形態学的ドメインに区別される：「間質ラメラ」と呼ばれる「グラナ'とグラナを相互接続積み重ね膜と呼ばしっかり密着膜領域、1。植物や藻類チラコイド膜の様々な凍結破壊の研究は1970年代初めに開始し、行われています。とき凍結破砕、膜細胞区画に応じて、exoplasmic顔（EF）と原形質顔（PF）を生成、それらの疎水性コア2に沿って分割する半膜ボーダー、もともとBranton らによって造語として。 。それぞれ、 'S'と'U'表す「積み重ね」と「アンスタック」膜領域と、EFでは、EFU、のPFとPFU：1975年3工場と藻類チラコイドは、4つの異なる破断面を有します。分割または破壊されていない膜タンパク質の複合体は、膜のE又はP側のいずれかに留まる傾向を有します。チラコイドの異なる破断面は、異なるサイズの粒子および密度4、及び続く多数の調査を含む初期の観察は、光反応を行う観察粒子と膜タンパク質複合体との間の識別と相関関係につながっ5-13 （また、14,15をレビュー参照）。
FREチラコイド膜のエズ-破壊実験は、通常、単離手順中に発生する可能性があり、構造的および/ または超分子組織内の任意の変化の危険にさらされ、（ただし、16,17を参照）葉緑体または単離されたチラコイド膜の調製物に対して実施されます。破砕後、レプリカが厚いカーボンの層（C）、および生物学的材料18の最終的に消化し て、その後、白金/カーボン（白金/ C）を蒸 発させることによって調製されます。複製は、透過型電子顕微鏡（TEM）によって可視化されます。従来の凍結割れレプリカ法は、 例えば 、光合成膜と異なるへの適応の超分子組織を研究するための重要なツールとして機能し続けています。、光、条件19-23。
homoiochlorophyllous復活工場Craterostigmaのpumilum 24の我々の最近の研究では、超分子組織Oの変化を調査することを目的としましたチラコイド膜Fも含め全体としての細胞組織内の、脱水及び再水和中。 homoiochlorophyllous復活種の独自性は、彼らが彼らの光合成装置を保持しながら、それらの栄養組織（葉）で乾燥の条件を生き残ることができるということです。水が利用可能になると、これらの植物は回復し、数日25時間以内に光合成活動を再開する。この研究のために、凍結破砕葉試料の低温走査EM（SEM）イメージングは、高圧力がサンプルクライオ固定化のために凍結と一緒にしました。これらの手順は、その天然の状態26に近い状態で凍結された水和生物学的サンプルを可視化する手段を提供します。一つの主な利点は、サンプルが無い連続工程で凍結破断し、塗布後に直接検討されていることです。その水和状態が準備中に維持されているように、これは、異なる相対含水率（RWC）での植物の調査に特に関連します。どうやってこれまでに、1つのクリティカルな欠点は、凍結水和サンプルは光合成複合体の大きさの正確な測定に必要な高倍率、でスキャンする場合は特に、撮影時の光損傷に苦しむ可能性があることです。これを克服するために、この方法は、特定のクライオSEM撮像条件を利用して組み合わせ「二層コーティング」（DLC）27,28と呼ばれます。これらは、有意に少ないビームと小文字が区別されたサンプルをもたらし、光合成タンパク質超分子組織と復活プラントCの他の細胞成分に関する貴重な情報の解明のために許可されましたその場で高倍率でpumilum。
Protocol
Representative Results
Discussion
この論文に記載された技術は、低温走査型電子顕微鏡によるよく保存高圧凍結した植物組織のコンテキスト内で凍結破断した膜の調査を可能にします。これらの手順を使用することの主な利点は、試料調製は、純粋に物理的なことです。化学物質や脱水を伴う全く手順は必要ありません。これにより、ネイティブに近い状態26,32で生物学的構造を研究することができます。葉組織を使…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、電子顕微鏡イメージングをスキャンする上で彼の有益な助言のためのアンドレスKaech（チューリッヒ大学）を感謝します。この作品は、米国・イスラエル国間農業研究と開発基金（無許可。US-4334から10を、ZR）を、イスラエル科学財団（無許可。1034年から1012年に、ZR）を、ヒューマン・フロンティア・サイエンス・プログラムによってサポートされていました（RGP0005 / 2013、ZR）。電子顕微鏡研究は、ワイツマン科学研究所でナノ・バイオ・ナノイメージング用アーヴィングとChernaモスコウィッツセンターで行われました。
Materials
| ethanol abs | Bio-Lab | 052505 | |
| isopropanol | Bio-Lab | 162605 | |
| 1-hexadecene | Sigma-Aldrich | H7009 | |
| 0.1/0.2 platelets | Engineering Office M. Wohlwend GmbH, Switzerland | 241 | Platelets are of 3-mm diameter and 0.5-mm-thick (Type A) with 0.1/0.2-mm-deep cavities (of diamater 2 mm). Similar platelets can be obtained from Leica Microsystems. |
| high-precision-grade tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72706-01 | Dumont (Switzerland) Durostar style #5 tweezers; Can be substituted with other high-precision tweezers. |
| high-pressure freezing machine | Bal-Tec | HPM 010 | High-pressure freezing alternatives: 1. HPF Compact 02, Wohlwend GmbH; 2. HPM 010, RMC Boeckeler; 3. EM PACT2, Leica Microsystems; 4. EM HPM 100, Leica Microsystems; 5. EM ICE, Leica Microsystems. |
| freeze-fracture system | Leica Microsystems | EM BAF 060 | |
| cryo preparation loading stage | Leica Microsystems | 16770228 | |
| specimen holder for univeral freeze fracturing | Leica Microsystems | 16LZ04746VN | Clamp holder for specimen carriers of diameter 3 mm |
| vacuum cryo-transfer shuttle | Leica Microsystems | EM VCT 100 | |
| scanning electron microscope | Zeiss | Ultra 055 | |
| cryo SEM stage | Leica Microsystems | 16770299905 | |
| image acquisiton software | SmartSEM, Carl Zeiss Microscopy GmbH | ||
| image analysis software | Fiji/Image J, National Institute of Health | http://fiji.sc/Fiji |
Riferimenti
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