A protocol to quantify bacterial 16S rRNA genes and transcripts from coastal sediments via real-time PCR is provided. The methodology includes the co-extraction of DNA and RNA; preparation of DNA-free RNA; and 16S rRNA gene and transcript quantification via RT-q-PCR, including standard curve construction.
Real Time Polymerase Chain Reaction også kendt som kvantitativ PCR (q-PCR) er et meget anvendt værktøj i mikrobiel økologi at kvantificere gen mængderne af taksonomiske og funktionelle grupper i miljøprøver. Anvendes i kombination med en revers transkriptase reaktion (RT-Q-PCR), kan det også anvendes til at kvantificere gentranskripter. q-PCR gør brug af meget følsomme fluorescerende påvisningsmetoder kemier, der tillader kvantificering af PCR amplikoner under den eksponentielle fase af reaktionen. Derfor er fordomme forbundet med 'end-point' PCR detekteret i plateau fase af PCR-reaktionen undgås. En protokol til at kvantificere bakterielle 16S rRNA-generne og udskrifter fra kystsedimenter via real-time PCR er tilvejebragt. Først en fremgangsmåde til co-ekstraktion af DNA og RNA fra kystsedimenter, herunder de yderligere trin, der kræves til fremstilling af DNA-fri RNA, er skitseret. For det andet, en trin-for-trin guide til kvantificering af 16S rRNA-gener og transcripts fra de ekstraherede nukleinsyrer via q-PCR og RT-q-PCR er skitseret. Dette omfatter oplysninger om konstruktion af DNA og RNA standard kurver. Vigtige overvejelser for brug af RT-Q-PCR-analyser i mikrobiel økologi er inkluderet.
Mikroorganismer er hjørnestenen i biosfæren kørsel økosystem funktion. Størstedelen af mikroorganismer fortsat uncultured 1. molekylære tilgange er derfor grundlæggende for at fremme vores forståelse af mangfoldighed og funktion af mikroorganismer i miljøet. Centralt for disse fremgangsmåder er udvinding af nukleinsyrer fra miljøprøver og den efterfølgende amplifikation af målgener ved hjælp af polymerasekædereaktion (PCR).
Det første trin af DNA / RNA-ekstraktion formål at lysere cellevæggene i det mikrobielle samfund stede, fjerne uønskede ikke-nukleinsyre-molekyler (fx organiske og uorganiske stoffer) og fastholde DNA / RNA i opløsning til længere nedstrøms analyse. Blandt flere muligheder i litteraturen 2,3,4,5, herunder en række kommercielle udvinding kits er Griffiths metode 6 bredt ansat 7,8,9. Det er omkostningseffektivt og particularly velegnet til sedimenter, som det anvender en perle-bankende trin at lysere celler og inkorporerer skridt til at minimere co-ekstraktion af PCR-inhibitorer, såsom humussyrer, og samtidig udvinding af DNA og RNA.
Det andet trin anvender polymerasekædereaktion (PCR) til at amplificere mål-gener, såsom 16S rRNA taksonomiske markering, fra de ekstraherede nukleinsyrer. Denne fremgangsmåde har og fortsætter med at gøre det lettere at udforskning af karakteriseret mikrobielle sorte boks 10,11. Imidlertid lider end-point PCR-baserede metoder fra forskellige begrænsninger, kan bias karakterisering af mikrobielle samfund 12. Til præcist at kvantificere genet / transcript mængderne skal realtids-PCR, også kendt som kvantitativ PCR (qPCR) anvendes. qPCR udnytter fluorescerende reporter farvestof systemer, der sporer amplicon akkumulation efter hver cyklus af PCR. Dette er væsentligt, da det betyder, at kvantificering kan forekomme under den tidlige eksponentielle fase, snarereend endepunkt, fase af PCR-reaktionen, når amplicon Udbyttet er stadig direkte proportional med den oprindelige overflod af målgenet.
To reportersystemer er almindeligt anvendt: en interkalaterende nukleinsyre pletten 13 og 5 '3' exonukleaseaktivitet af DNA-polymerasen 14. Da den tidligere reporter-system binder indistinctively til alle dobbeltstrenget DNA, kan det føre til en overvurdering af målsekvensen, hvis der opstår uønskede ikke-specifikke amplikoner eller primerdimerer af produkter. For at omgå dette, kan det være nødvendigt omfattende optimering af forstærkning. I sidstnævnte system er template amplifikation spores ved hjælp af en kombination af en 5'-nukleaseaktivitet af Taq-polymerase, som spalter en fluorofor fra en intern probe. Dette træk øger specificiteten af assayet på grund af anvendelsen af et fluorogent probe, som kun binder til det komplementære mål-specifikke sequence mellem primerparret. Med begge kemier kvantificering opnås ved at bestemme grænseovergang (Cp) når akkumuleringen af PCR amplikoner, som målt ved en stigning i fluorescens, er signifikant over baggrund fluorescens.
qPCR har været udbredt hos mikrobiel økologi til bestemmelse gen mængderne i forskellige miljøer 15. Endvidere er revers transkription af RNA til cDNA kombineret med qPCR og RT-qPCR at kvantificere genekspression. Derfor qPCR og RT-qPCR repræsenterer hurtige, effektive metoder til kvantificering af gen og / eller udskrift numre inden miljøprøver.
Mikroorganismer i kystnære sedimenter drive forskellige økosystemprocesser, herunder mineralisering af organisk stof, nedbrydningen af forurenende stoffer, og det biogeokemiske kredsløb af makronæringsstoffer som kvælstof 16,17,18. Den udtømmende forståelse af disse transformationer kræver en omfattende regnskabst af de medvirkende mikrobielle populationer, herunder kvantitative data om gen- og transcript mængderne. Her introducerer vi en række gennemtestede, strømlinede og standardiserede protokoller til kvantificering af bakterielle 16S rRNA-genet og afskrift mængderne i kystnære sedimenter. Protokollen skitserer prøveindsamling, samtidig DNA og RNA-ekstraktion, DNA-fri RNA-præparat, kvalitet kontrol af ekstraherede nukleinsyrer, generering af 16S rRNA-DNA og -RNA standarder og kvantificering af miljøprøver. Kvantitative data fra de metoder, der er beskrevet her, er der behov for at kaste lys over mikrobielle samfund kørsel kystnære økosystemer.
Kombinationen af DNA / RNA-ekstraktion med qPCR tilbyder en hurtig, nøjagtig, relativt omkostningseffektiv fremgangsmåde til følsom kvantificering af gen- og transkript mængderne fra en række miljømæssige prøver, såsom kystsedimenter.
Den oprindelige nukleinsyre ekstraktion er det kritiske trin for at sikre en repræsentativ afbildning af den mikrobielle samfund foreliggende opnås 22. Skal overvejes til ekstraktionen protokol En række begrænsninger: a) opnåelse af total cellelyse, b) co-ekstraktion af inhibitoriske forbindelser (f.eks huminsyrer eller polyphenoler), c) kontaminerende DNA i RNA-fraktion, d) hurtig nedbrydning af ekstraherede nukleinsyrer ved opbevaring. Der skal træffes forholdsregler med henblik på at omgå disse begrænsninger. For eksempel, særlig omhu skal træffes for at sikre, at udvindingen af nukleinsyrer er optimeret til prøven (f.eks, sedimenter, jord, spildevand, etc.). Signifikante forbedringer i nukleinsyre udbytte og kvalitet til både DNA og RNA kan opnås ved at udføre indledende forsøg 23. For at minimere virkningen af inhibitoriske forbindelser på PCR-baserede applikationer 24, teste en række fortyndinger fra det ekstraherede DNA og RNA. For at omgå den hurtige nedbrydning af det ekstraherede DNA / RNA fra flere fryse-tø-cykler og undgå eventuelt tab af genetisk information, gemme flere små volumen alikvoter ved -80 ° C.
Når omhyggeligt designet, qPCR er en robust, meget reproducerbar og følsom metode. Især kan metoderne til forstærkning og standardkurve konstruktion er skitseret i denne protokol tilpasses til enhver gen mål af interesse, herunder andre fylogenetiske markører (dvs. arke 16S rRNA, svampe- 18S rRNA) eller gener involveret i vigtige funktioner i miljøet. Kendte begrænsninger i brugen af qPCR er: a) generering af reproducerbar høj kvalitet standard kurve for absolut kvantificering, b) valg af primer / sonder og optimering af q-PCR assay betingelser, c) brug af lav kvalitet / klippet nukleinsyrer, d) valget af den fortynding af DNA / RNA for at undgå hæmning . Desuden skal det overvejes, at qPCR teknik giver gen / udskrift mængderne, som ikke kan svare til celletal: Dette er især tilfældet, når 16S og 18S rRNA-generne er målrettet, da mikroorganismer har forskellige kopi numre af ribosomale gen i deres genom 25.
Dårlig kvalitet standardkurver vil resultere i unøjagtig kvantificering af genet af interesse. Det er god praksis at gemme et lager af høje koncentrationsstandarder i små portioner, hvorfra friske standardkurver kan gøres. Må ikke opbevares standardkurver, altid friske fortyndinger fra en bestand af den højeste koncentration hver gang. For nøjagtig kvantificering af miljøprøver sikrer række koncentrationer af den standard kurve spænder de forventede Cp værdier af de ukendte prøver. Når kvantificering transkripter, konstruere standardkurven fra RNA ikke dobbeltstrenget DNA. Når det er muligt, bør kvantificering af prøver, der skal direkte sammenlignes være afsluttet inden for et enkelt assay for at undgå inter-assay variation 20. Dette kan ikke altid være muligt. Derfor, for at sammenligne gen-mængderne genereret mellem analyser er det tilrådeligt at have en tilfældig delmængde af prøver replikeres mellem analyser. Et bredt udvalg af primer og probe sæt er i øjeblikket tilgængelig for qPCR målrette mikrobiel taxa og funktionelle grupper 15. Omhyggelig overvejelse er nødvendig, når du vælger disse for at sikre både maksimal dækning og specificitet for målgruppen. Hvis reaktionen effektiviteten af en qPCR assay er ikke tilfredsstillende, starter fejlfinding med at teste forskellige termisk cykling forhold (annealing tid og / eller temperatur) og / eller reaktionsbetingelser, fx varierende primer-probe-koncentrationer. Once Q-PCR assay og reaktionsbetingelserne optimeres, altid foretage en indledende test af en række DNA / cDNA fortyndinger at fastsætte en passende skabelon koncentration. Vælg fortyndingsområdet resulterer i den højeste kopiantal som den optimale skabelon fortynding for yderligere assays.
I øjeblikket, næste generation sekventering teknologier effektivt belyse mikrobielle samfund struktur og funktioner i et væld af miljøer 26,27,28. Men disse datasæt ofte baseret på end-point PCR amplicon biblioteker og giver derfor kun semi-kvantitative vurderinger af den overflod af særlig taxa. Derfor til evnen til real time PCR-baserede teknik målrette specifikke taksonomiske markører (fra højere domænet ned til stamme) giver mulighed for effektiv validering af de opnåede resultater ved næste generations sekventering. Desuden qPCR held har været anvendt i kombination med andre mikrobielle økologi molekylære metoder såsom stabil isoTope sondering (SIP) eller fylogenetiske / funktionelle mikroarrays. Kombineret med den tidligere værktøj, kan qPCR bruges til at kvantificere metabolisk aktive samfund 29,30. Når det kombineres med microarray analyse, qPCR giver nøglen kvantitativ fortolkning af fylogenetiske markør-baserede og funktionelle gen undersøgelser af miljøer 31,32.
Derfor anvendes enten alene eller i kombination med andre (ofte proces-baseret) vurderinger af økosystemets funktion, kvantitativ PCR er et vigtigt redskab for mikrobielle økologer i udforskningen af den undvigende forbindelse mellem mikrobielle samfund og økosystemfunktioner.
The authors have nothing to disclose.
Denne publikation udgik fra forskning gennemført med økonomisk støtte fra Natural Environment Research Council (NERC) under tilskud nummer NERC NE / JO11959 / 1 og Science Foundation Ireland & Marie-Curie Action COFUND under Grant Number 11 / SIRG / B2159awarded til CJS og den østlige Academic Research Consortium (Eastern ARC).
Diethylpyrocarbonate | Sigma | 40718 | Toxic, open under chemical hood |
cetrimonium bromide (CTAB) | Sigma | 52365 | Irritant, open under chemical hood |
potassium phosphate dibasic | Sigma | RES20765 | |
potassium phosphate monobasic | Sigma | P9791 | |
Phenol:Chloroform:Isoamylalcohol pH 8 | Sigma | P2069 | Equilibrate at pH 8 before using |
Chloroform:Isoamylalcohol | Sigma | 25666 | |
sodium chloride | VWR | 1.06404.0500 | |
polyethylenglycol 6000 | VWR | 528877-100 | |
Ethanol Molecular Grade | Sigma | E7148 | |
Lysing Matrix E tubes | MP Biomedical | 116914050 | |
Turbo DNAse | Ambion | AM1907 | |
Taq polymerase | Sigma | D1806 | |
dNTPs | Bioline | BIO-39028 | |
SuperScript III | Life Technologies | 18080044 | |
Rnase Inhibitor | Life Technologies | 10777019 | |
RNAse/DNAse free 0.2 ml PCR tubes | Sarstedt | 72.985.002 | |
SureCleanPlus | Bioline | BIO-37047 | |
pGEM Easy T Vector | Promega | A1360 | |
E. coli JM109 competent cells | Promega | L2005 | |
Tryptone | Sigma | T7293 | |
Yeast Extract | Sigma | 70161 | |
Ampicillin | Sigma | 59349 | |
X-Gal | Bioline | BIO-37035 | |
IPTG | Bioline | BIO-37036 | |
Agar | VWR | 20768.235 | |
Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12143 | |
Qubit | Life Technologies | Q33216 | |
Quant-IT DNA HS Assay | Life Technologies | Q-33120 | |
Quant-IT RNA HS Assay | Life Technologies | Q32855 | |
MEGAshortscript kit | Ambion | AM1354 | |
TaqMan SensiFast Probe Lo-ROX kit | Bioline | BIO-84002 | |
qPCR machine |