Прижизненной визуализации нейтрофилов Грунтовка Использование IL-1 промотором управляемые Dsred Reporter Мыши
Summary
This current protocol employs fluorescent reporters, in vivo labeling, and intravital imaging techniques to enable monitoring of the dynamic process of neutrophil priming in living animals.
Abstract
Нейтрофилы являются наиболее распространенными лейкоциты в обращении крови человека и быстро завербован в местах воспаления. Грунтовка является важным событием, которое усиливает фагоцитарную функциональность нейтрофилов. Несмотря на обширные исследования обнародовали существование и важность нейтрофильного затравки во время инфекции и травмы, средства визуализации этого процесса в естественных условиях были недоступны. Протокол при условии , позволяет осуществлять мониторинг динамического процесса нейтрофильных грунтовкой в живых животных путем объединения трех методик: 1) DsRed репортер сигнал – используется в качестве меры затравочных 2) в естественных условиях маркировки нейтрофильной – достигается путем введения флуоресцентной конъюгированных с анти-лимфоцитарный антиген 6G (Ly6G) моноклональное антитело (МАБ) и 3) прижизненной конфокальной микроскопии. Несколько важных шагов участвуют в этом протоколе: оксазолона-индуцированное воспаление уха мыши кожи, соответствующий седации животных, повторные инъекции анти-Ly6G биосфера, и предention фокуса дрейфа во время съемки. Хотя некоторые ограничения наблюдались, такие как предел непрерывного времени изображений (~ 8 часов) в одной мыши и утечки флуоресцеина изотиоцианат-декстрана из кровеносных сосудов в воспалительный состоянии, этот протокол обеспечивает фундаментальную основу для прижизненной визуализации загрунтованную поведение нейтрофилами и функция, которая может быть легко расширена для изучения других иммунных клеток в моделях воспаления мыши.
Introduction
Нейтрофилы являются наиболее распространенными и короткоживущие лейкоциты в обращении. Они быстро набраны к местам инфекции или травмы, где они служат профессиональные фагоциты через высвобождением активного кислорода и азота промежуточных продуктов наряду с гранулами , содержащими антимикробные пептиды и протеазы 1. Во время их набора, нейтрофилы "грунтовкой" различными агентами , включая микробные продукты, хемоаттрактанты и воспалительных цитокинов, в результате чего заметно расширенные функциональные возможности фагоцитарного по прибытии в месте воспаления 2. Механизмы нейтрофильных затравки были широко изучены в пробирке 3,4; Тем не менее, динамический контроль процесса в естественных условиях не представлялось возможным на сегодняшний день.
В последнее время прижизненной визуализации стало важным методом для визуализации и количественной оценки клеточных динамики биологических процессов в живых организмах. Intraviвизуализация Таль может быть осуществлено с помощью обычного однофотонного микроскопии возбуждения (например, конфокальной) или многофотонной микроскопии приближается к 5. Со временем, значительные улучшения были достигнуты в этой технике позволяет увеличить разрешение изображения, улучшенную глубину изображения, снижение фотоповреждения ткани и повышенной стабилизации изображения 6,7. Учитывая свою уникальную возможность включения динамической визуализации клеточной миграции и взаимодействия с течением времени, прижизненной микроскопии широко применяется в различных областях исследования в области иммунологии 8. Прижизненные изображения позволяет иммунологи, чтобы лучше понять и контекстуализировать иммунные реакции на обоих клеточном и молекулярном уровне в живых животных моделей.
Последние достижения в области трансгенной, а также забивные репортер мышей предоставили полезные инструменты для мониторинга динамического поведения нейтрофилов у живых животных. Лизоцим M промотор-приводом усиленный зеленый флуоресцентный белок забивныеМыши были широко используются для характеристики моторики нейтрофилов, моноцитов и макрофагов во время различных воспалительных процессов , в том числе экстравазации, бактериальной инфекции, и стерильного воспаления 9-15. Кроме того, трансгенные мыши , экспрессирующие цитоплазматический флуоресцентного резонансного переноса энергии биосенсора были использованы при изучении деятельности нейтрофилов внеклеточной регулируемой киназы митоген и протеинкиназы А в воспаленном кишечнике 16. Мышиной модели с высокой степенью специфичности экспрессии флуоресценции в нейтрофилах является Catchup стук в мышь, которая производит Cre рекомбиназу, а также флуоресцентного белка tdTomato, который сам по себе связан с экспрессией лимфоцитарных антиген 6G (Ly6G) 17. Визуализация Ly6G-дефицитных нейтрофилов через эту модель показала , что эти клетки оказывают нормальные функциональные возможности в различных стерильных или инфекционных в естественных условиях воспалительных контекстах. Трансгенные мыши, экспрессирующие DsRed флуоресцентный рrotein ген под контролем мыши interleuikin-1 & beta; (ИЛ-1β) промотор (pIL1-DsRed) были использованы для визуализации подвижных поведения IL-1 & beta; продуцирующих клеток – как полагают, включают нейтрофилы, воспалительных моноциты и активированные макрофаги – возникающие в воспаленной кожи 18.
В естественных условиях маркировки может служить в качестве альтернативного подхода для отслеживания клеточных и молекулярных поведения нейтрофилов в воспаленных тканях. После внутривенного введения низких доз флуоресцентно меченных анти-Gr-1 моноклональное антитело (МАБ), набор каскад Gr-1 + нейтрофилов было визуализируется при поражении кожи мышей , зараженных золотистым стафилококком 19. В естественных условиях введение конъюгатов , содержащих стрептавидином конъюгированные 705 нм квантовые точки и биотинилированный анти-Ly6G монАТ специфически маркировать циркулирующие нейтрофилы 20. Кроме того, эндоцитоз таких конъюгатов в neutrophIL везикулы позволяет отслеживать высокоскоростного везикул транспорта в нейтрофилах мигрирующие в интерстиций. В естественных условиях маркировки с флуоресценцией , конъюгированных с антителами против Р-селектина гликопротеинов лиганд-1 (PSGL-1), L-селектина (CD62L), интегрин аш (CD11b ) и хемокина (СХС мотив) рецептора 2 (CXCR2) в ФНО-индуцированной воспалительной модель выяснен регуляторные механизмы при игре на ранних стадиях воспаления 21. Поляризованные нейтрофилы выступают PSGL-1, обогащенный Уроподы взаимодействовать с CD62L на активированных тромбоцитах, что приводит к перераспределению CD11b и CXCR2, рецепторы, которые управляют миграцию нейтрофилов и инициируют воспаление.
ИЛ-1β является одним из генов подписи , что повышается в загрунтованных нейтрофилы 22. У мышей репортер pIL1-DsRed, DsRed сигналы флуоресценции (то есть., Активация IL-1 промотор) положительно коррелирует с IL-1β экспрессию мРНК и IL-1β продуцирования белка. <SUP> 18 Для того, чтобы следить за процессом нейтрофильной затравки, была разработана прижизненный метод микроскопии с участием индукции воспаления кожи с оксазолона (ОХ) в мышиной модели pIL1-DsRed следующую маркировку в естественных условиях нейтрофилов с флуоресцентно-конъюгированным анти-Ly6G мАт. С помощью этой модели, можно изучить поведение и функцию загрунтованных нейтрофилами в животных моделях различных заболеваний и расстройств.
Protocol
Representative Results
Discussion
Целью данного исследования является разработка технологии для мониторинга процесса нейтрофильной затравки в живых животных, которые еще не были выполнены с помощью имеющихся в настоящее время методов. Для достижения этой цели, три установленные методики выполняются: 1) индукция восп?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have no acknowledgements.
Materials
| Heparin sodium | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-540-31 | |
| ACK lysing buffer | Lonza | 10-548E | |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| Lipopolysaccharides | Sigma-Aldrich | L4391 | |
| Ketamine hydrochloride | Hospira | NDC 0409-2051-05 | |
| Xylazine | LLOYD Laboratory | NADA #139-236 | |
| Acepromazine | Boehringer Ingelheim | ANADA 200-361 | |
| Hair-removal cream | Church & Dwight | ||
| Acetone | Fisher Scientific | A16P4 | |
| Oxazolone | Sigma-Aldrich | E0753 | |
| Alexa Fluor 647 anti-mouse Ly6G antibody | BioLegend | 127610 | |
| U-100 insulin syringe with 28 G needle | BD | 329461 | |
| FITC-CM-Dextran, 150 Kda | Sigma-Aldrich | 74817 | |
| Butterfly infusion set (27 G needle) | BD | 387312 | |
| FACSCalibur cytometer | BD | ||
| CellQuest Pro software | BD | ||
| Confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| Metamorph Software | Universal Imaging |
Riferimenti
- Nauseef, W. M., Borregaard, N. Neutrophils at work. Nat. Immunol. 15 (7), 602-611 (2014).
- Kobayashi, S. D., Voyich, J. M., Burlak, C., DeLeo, F. R. Neutrophils in the innate immune response. Arch. Immunol. Ther. Exp. (Warsz). 53 (6), 505-517 (2005).
- Condliffe, A. M., Kitchen, E., Chilvers, E. R. Neutrophil priming: pathophysiological consequences and underlying mechanisms. Clin. Sci. (Lond). 94 (5), 461-471 (1998).
- El-Benna, J., Dang, P. M., Gougerot-Pocidalo, M. A. Priming of the neutrophil NADPH oxidase activation: role of p47phox phosphorylation and NOX2 mobilization to the plasma membrane. Semin. Immunopathol. 30 (3), 279-289 (2008).
- Benson, R. A., McInnes, I. B., Brewer, J. M., Garside, P. Cellular imaging in rheumatic diseases. Nat. Rev. Rheumatol. 11 (6), 357-367 (2015).
- Herz, J., Zinselmeyer, B. H., McGavern, D. B. Two-photon imaging of microbial immunity in living tissues. Microsc. Microanal. 18 (4), 730-741 (2012).
- Tang, J., van Panhuys, N., Kastenmuller, W., Germain, R. N. The future of immunoimaging–deeper, bigger, more precise, and definitively more colorful. Eur. J. Immunol. 43 (6), 1407-1412 (2013).
- Weigert, R., Porat-Shliom, N., Amornphimoltham, P. Imaging cell biology in live animals: ready for prime time. J. Cell. Biol. 201 (7), 969-979 (2013).
- Ng, L. G., et al. Visualizing the neutrophil response to sterile tissue injury in mouse dermis reveals a three-phase cascade of events. J. Invest. Dermatol. 131 (10), 2058-2068 (2011).
- Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107 (42), 18073-18078 (2010).
- Finsterbusch, M., Voisin, M. B., Beyrau, M., Williams, T. J., Nourshargh, S. Neutrophils recruited by chemoattractants in vivo induce microvascular plasma protein leakage through secretion of TNF. J. Exp. Med. 211 (7), 1307-1314 (2014).
- Lin, A., Loughman, J. A., Zinselmeyer, B. H., Miller, M. J., Caparon, M. G. Streptolysin S inhibits neutrophil recruitment during the early stages of Streptococcus pyogenes infection. Infect. Immun. 77 (11), 5190-5201 (2009).
- Howe, C. L., Lafrance-Corey, R. G., Sundsbak, R. S., Lafrance, S. J. Inflammatory monocytes damage the hippocampus during acute picornavirus infection of the brain. J. Neuroinflammation. 9 (50), (2012).
- Chen, X., et al. In vivo multi-modal imaging of experimental autoimmune uveoretinitis in transgenic reporter mice reveals the dynamic nature of inflammatory changes during disease progression. J. Neuroinflammation. 12 (17), (2015).
- Slaba, I., et al. Imaging the Dynamic Platelet-Neutrophil Response in Sterile Liver Injury and Repair in Mice. Hepatology. , (2015).
- Mizuno, R., et al. In vivo imaging reveals PKA regulation of ERK activity during neutrophil recruitment to inflamed intestines. J. Exp. Med. 211 (6), 1123-1136 (2014).
- Hasenberg, A., et al. Catchup: a mouse model for imaging-based tracking and modulation of neutrophil granulocytes. Nat. Methods. 12 (5), 445-452 (2015).
- Matsushima, H., et al. Intravital imaging of IL-1beta production in skin. J. Invest. Dermatol. 130 (6), 1571-1580 (2010).
- Yipp, B. G., Kubes, P. Antibodies against neutrophil LY6G do not inhibit leukocyte recruitment in mice in vivo. Blood. 121 (1), 241-242 (2013).
- Kikushima, K., Kita, S., Higuchi, H. A non-invasive imaging for the in vivo tracking of high-speed vesicle transport in mouse neutrophils. Sci. Rep. 3, (1913).
- Sreeramkumar, V., et al. Neutrophils scan for activated platelets to initiate inflammation. Science. 346 (6214), 1234-1238 (2014).
- Yao, Y., et al. Neutrophil priming occurs in a sequential manner and can be visualized in living animals by monitoring IL-1beta promoter activation. J. Immunol. 194 (3), 1211-1224 (2015).
- Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet. Lab Anim. (NY). 34 (9), 39-43 (2005).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice). Lab. Anim. (NY). 40 (5), 155-160 (2011).
- Fotos, J. S., et al. Automated time-lapse microscopy and high-resolution tracking of cell migration). Cytotechnology. 51 (1), 7-19 (2006).
- Mizumoto, N., et al. Discovery of novel immunostimulants by dendritic-cell-based functional screening. Blood. 106 (9), 3082-3089 (2005).
- Cassatella, M. A. Neutrophil-derived proteins: selling cytokines by the pound. Adv. Immunol. 73, 369-509 (1999).
- Grahames, C. B., Michel, A. D., Chessell, I. P., Humphrey, P. P. Pharmacological characterization of ATP- and LPS-induced IL-1beta release in human monocytes. Br. J. Pharmacol. 127 (8), 1915-1921 (1999).
- Levin, M., Leibrecht, H., Ryan, J., Van Dolah, F., De Guise, S. Immunomodulatory effects of domoic acid differ between in vivo and in vitro exposure in mice. Mar. Drugs. 6 (4), 636-659 (2008).
- Basu, S., Hodgson, G., Katz, M., Dunn, A. R. Evaluation of role of G-CSF in the production, survival, and release of neutrophils from bone marrow into circulation. Blood. 100 (3), 854-861 (2002).
- Kreft, M., Stenovec, M., Zorec, R. Focus-drift correction in time-lapse confocal imaging. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1048, 321-330 (2005).
- Zucker, R. M. Quality assessment of confocal microscopy slide-based systems: instability. Cytometry A. 69 (7), 677-690 (2006).
- Hogan, H. Focusing on the experiment. Biophotonics. Int. 13, 48-51 (2006).
- Kabashima, K., Egawa, G. Intravital multiphoton imaging of cutaneous immune responses. J. Invest. Dermatol. 134 (11), 2680-2684 (2014).
- Egawa, G., Natsuaki, Y., Miyachi, Y., Kabashima, K. Three-dimensional imaging of epidermal keratinocytes and dermal vasculatures using two-photon microscopy. J. Dermatol. Sci. 70 (2), 143-145 (2013).
- Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nat. Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A method for 2-photon imaging of blood flow in the neocortex through a cranial window. J. Vis. Exp. (12), (2008).
- Ritsma, L., et al. Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy. Nat. Protoc. 8 (3), 583-594 (2013).
- Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nat. Methods. 8 (1), 91-96 (2011).
