Questo protocollo attuale impiega reporter fluorescenti, marcatura in vivo e tecniche di imaging intravitale per consentire il monitoraggio del processo dinamico di priming dei neutrofili negli animali viventi.
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Articolo metodologico
Imaging intravitale di neutrofili adescamento Utilizzando IL-1b Promoter-driven DsRed topi reporter
In questo articolo
Sommario
Abstract
I neutrofili sono i leucociti più abbondanti in circolazione del sangue umano e sono rapidamente reclutati ai siti infiammatori. L'adescamento è un evento critico che aumenta la funzionalità fagocitaria dei neutrofili. Sebbene studi approfonditi hanno svelato l'esistenza e l'importanza di neutrofili adescamento durante l'infezione e lesioni, i mezzi di visualizzare questo processo in vivo sono stati disponibili. Il protocollo fornito consente il monitoraggio del processo dinamico di neutrofili adescamento in animali viventi combinando tre metodologie: 1) Segnale giornalista DsRed - usato come misura di adescamento 2) in vivo etichettatura neutrofili - ottenuto mediante iniezione di fluorescenza coniugato antigene anti-linfociti 6G (Ly6G) anticorpo monoclonale (mAb) e 3) confocale intravitale. Diversi passaggi critici sono coinvolti in questo protocollo: Mouse infiammazione oxazolone indotta pelle orecchio, adeguata sedazione degli animali, ripetute iniezioni di anti-Ly6G mAb, e prevenzione fuoco deriva durante l'imaging. Sebbene alcune limitazioni sono stati osservati, come il limite di tempo di imaging continuo (~ 8 ore) in un mouse e la fuoriuscita di fluorescina isotiocianato-destrano dai vasi sanguigni in stato infiammatorio, questo protocollo fornisce un quadro fondamentale per l'imaging intravitale di comportamento innescato neutrofili e la funzione, che può essere facilmente ampliato per l'esame di altre cellule del sistema immunitario in modelli murini di infiammazione.
Introduzione
I neutrofili sono i più abbondanti e di breve durata leucociti in circolazione. Essi stanno rapidamente reclutati per i siti di infezione o lesioni, dove servono fagociti come professionisti attraverso il rilascio di reattivi intermedi ossigeno e di azoto insieme con granuli contenenti peptidi antimicrobici e proteasi 1. Durante il loro reclutamento, i neutrofili sono "innescato" da vari agenti compresi i prodotti microbici, chemoattractants, e citochine infiammatorie, con conseguente funzionalità dei fagociti nettamente migliorata all'arrivo in un sito di infiammazione 2. I meccanismi di priming neutrofili sono state ampiamente studiate
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Protocollo
Tutti gli esperimenti sugli animali vengono eseguiti in conformità con le linee guida del National Institutes of Salute e approvato dal Comitato di Cura e uso istituzionale degli animali dell'Università di Toledo.
1. Fenotipizzazione di pIL1-DsRed Mice
NOTA: Offspring sono generati da allevamento topi pIL1-DsRed eterozigoti con topi wild-type (WT) C57BL6. Da tre a quattro settimane di età cuccioli sono considerati pronti per fenotipizzazione. Sanguinamento sottomandibolare di topi segue un protocollo stabilito con piccole modifiche 23.
- Isolamento dei globuli bianchi dal sangue....
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Risultati
Proiezione di topi pIL1-DsRed è effettuata sulla base del segnale di fluorescenza fenotipica DsRed prodotto dai loro leucociti del sangue periferico mediante citometria a flusso. Stimolazione LPS è nota per indurre la produzione di IL-1β in cellule mieloidi, tra cui i neutrofili, monociti e cellule dendritiche 26-28. Così, leucociti isolati vengono incubate con LPS per 4 ore prima di citometria a flusso di analisi. Avanti, gating è fissato per viene misurata in questa popolazi.......
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Discussione
Lo scopo di questo studio è quello di sviluppare una tecnologia per il monitoraggio del processo di neutrofili adescamento in animali viventi, che non è stata ancora soddisfatte dalle tecniche attualmente disponibili. Per raggiungere questo obiettivo, tre metodologie consolidate vengono eseguiti: 1) induzione di infiammazione della pelle in topi reporter DsRed promotore-driven IL-1b come misura di priming, 2) in vivo etichettatura dei neutrofili con basse dosi di fluorescenza coniugato anti-Ly6G mAb, e 3) confo.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse finanziari.
Ringraziamenti
Gli autori non hanno riconoscimenti.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Eparina sodica | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-540-31 | |
| tampone di lisi ACK | Lonza | 10-548E | |
| Siero fetale bovino | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| Lipopolisaccaridi | Sigma-Aldrich | L4391 | |
| Ketamina cloridrato | Hospira | NDC 0409-2051-05 | |
| Xilazina | LLOYD Laboratory | NADA #139-236 | |
| Acepromazina | Boehringer Ingelheim | ANADA 200-361 | |
| Crema depilatoria | Church & Dwight | ||
| Acetone | Fisher Scientific | A16P4 | |
| Oxazolone | Sigma-Aldrich | E0753 | |
| Alexa Fluor 647 anti-topo Anticorpo Ly6G | BioLegend | 127610 | |
| Siringa da insulina U-100 con ago da 28 G | BD | 329461 | |
| FITC-CM-Dextran, 150 kDa | Sigma-Aldrich | 74817 | |
| Set per infusione a farfalla (ago da 27 G) | BD | 387312 | |
| FACSCalimetro | BD | ||
| CellQuest Pro software | BD | ||
| Microscopio confocale | Olympus | FV1000 | |
| Metamorph Software | Universal Imaging |
Riferimenti
- Nauseef, W. M., Borregaard, N. Neutrophils at work. Nat. Immunol. 15 (7), 602-611 (2014).
- Kobayashi, S. D., Voyich, J. M., Burlak, C., DeLeo, F. R. Neutrophils in the innate immune response. Arch. Immunol. Ther. Exp. (Warsz). 53 (6), 505-517 (2005).
- Condliffe, A. M., Kitchen, E., Chilvers, E.....
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Ristampe e permessi
