Intravital avbildning av neutrofila Priming Använda IL-1 Promoter drivna dsRed Reporter Möss

Summary

This current protocol employs fluorescent reporters, in vivo labeling, and intravital imaging techniques to enable monitoring of the dynamic process of neutrophil priming in living animals.

Abstract

Neutrofiler är de mest förekommande leukocyter i humant blodcirkulationen och snabbt rekryteras till inflammatoriska ställen. Priming är en kritisk händelse som förbättrar fagocytiska funktionerna av neutrofiler. Trots omfattande studier har avslöjat existensen och betydelsen av neutrofila priming under infektion och skada innebär att visualisera denna process in vivo har varit otillgänglig. Protokollet som tillhanda möjliggör övervakning av den dynamiska processen för neutrofil priming i levande djur genom att kombinera tre metoder: 1) DsRed reportersignal – används som ett mått på priming 2) in vivo neutrofil märkning – uppnås genom injektion av fluorescens-konjugerat anti-lymfocyt-antigen 6G (Ly6G) monoklonal antikropp (mAb) och 3) intravital konfokal avbildning. Flera viktiga steg är inblandade i detta protokoll: oxazolon-inducerad mus öra hudinflammation, lämplig sedering av djur, upprepade injektioner av anti-Ly6G mAb, och föregåendeention fokusAvvikelsen under avbildning. Även några begränsningar har iakttagits, såsom gränsen för kontinuerlig imaging tid (~ 8 h) i en mus och läckage av fluoresceinisotiocyanat-dextran från blodkärlen i den inflammatoriska tillstånd, ger detta protokoll en grundläggande ramen för intravital avbildning av primade neutrofila beteende och funktion, som lätt kan utökas till granskning av andra immunceller i mus inflammationsmodeller.

Introduction

Neutrofiler är de vanligast förekommande och kortlivade leukocyter i omlopp. De snabbt rekryteras till platserna för infektion eller skada, där de fungerar som professionella fagocyter genom frisättning av reaktiva syre- och kvävemellan tillsammans med granuler innehållande antimikrobiella peptider och proteaser ^1. Under deras rekrytering, neutrofiler "primas" genom olika medel, inklusive mikrobiella produkter, kemoattraherande ämnen och inflammatoriska cytokiner, vilket resulterar i markant förbättrade fagocyt funktionalitet vid ankomsten till en inflammationsstället ^2. Mekanismerna för neutrofila priming har studerats ingående in vitro ^3,4; emellertid, har dynamisk övervakning av processen in vivo inte varit möjligt hittills.

Nyligen har intravital avbildning blivit en viktig teknik för att visualisera och kvantifiera de cellulära dynamiken i biologiska processer i levande organismer. Intravital avbildning kan göras via konventionella-foton-excitation mikroskopi (t.ex. konfokal) eller multifotonmikroskop närmar ^5. Med tiden har avsevärda förbättringar gjorts i denna teknik som möjliggör ökad bildupplösning, förbättrad bilddjupet, minskad vävnadsfotoskador, och förbättrad bildstabilisering ^6,7. Med tanke på dess unika förmåga att möjliggöra dynamisk visualisering av cellulära migration och interaktion med tiden har intravital mikroskopi i stor utsträckning tillämpas på olika områden i studien i immunologi ^8. Intravital avbildning gör immunologer att bättre förstå och kontextualisera immunsvar på både cellulär och molekylär nivå i levande djurmodeller.

Senaste framstegen inom transgena samt knock-in reporter möss har gett användbara verktyg för att övervaka de dynamiska beteenden neutrofiler i levande djur. Lysozym M promotor drivna förbättrad grönt fluorescerande protein knock-inmöss har i stort sett används för att karaktärisera rörligheten av neutrofiler, monocyter och makrofager under olika inflammatoriska processer bland extravasering, bakteriell infektion, och steril inflammation ^9-15. Vidare har transgena möss som uttrycker en cytoplasmisk fluorescensresonansenergiöverföring biosensor använts för att studera verksamheten i neutrofila extracellulärt reglerad mitogen kinas och proteinkinas A inom inflammerad tarm ^16. En murin modell med hög specificitet för fluorescens expression i neutrofiler är Catchup knock-in mus, som producerar Cre-rekombinas samt det fluorescerande proteinet tdTomato, som i sig är kopplad till expression av lymfocytantigen 6G (Ly6G) ^17. Visualisering av Ly6G-saknande neutrofiler via denna modell har visat att dessa celler utövar normal funktion i en variation av sterila eller infektiösa in vivo inflammatoriska sammanhang. Transgena möss som uttrycker den DsRed fluorescerande protein-genen under kontroll av mus interleuikin-1β (IL-1β) promotor (pIL1-DsRed) har använts för att visualisera de motila beteenden av IL-1 p-producerande celler – antas innefatta neutrofiler, inflammatoriska monocyter och aktiverade makrofager – emerging i inflammerad hud ^18.

In vivo märkning kan tjäna som ett alternativ för att spåra de cellulära och molekylära beteenden neutrofiler i inflammerade vävnader. Efter intravenös injektion av låga doser av fluorescensmärkta anti-Gr-1 monoklonal antikropp (mAb), rekrytering kaskad av Gr-1 ⁺ neutrofiler har visualiseras i mus hudlesioner infekterade med Staphylococcus aureus ^19. In vivo-administrering av konjugat innehållande streptavidin- konjugerade 705 nm kvantprickar och biotinylerad anti-Ly6G mAb märka specifikt cirkulerande neutrofiler ^20. Dessutom endocytos av sådana konjugat i neutrophil vesiklar möjliggör spårning av höghastighets vesikel transport i neutrofiler migrerar in interstitium. In vivo märkning med fluorescens konjugerade antikroppar mot P-selektin glykoprotein ligand-1 (PSGL-1), L-selektin (CD62L), integrin αM (CD11b ) och kemokin (CXC motiv) receptor 2 (CXCR2) i en TNF-inducerad inflammatorisk modell har klar de regleringsmekanismer som spelar under tidig inflammation ^21. Polariserade neutrofiler sticker PSGL-1-berikade uropods att interagera med CD62L närvarande på aktiverade blodplättar, vilket resulterar i omfördelning av CD11b och CXCR2, receptorer som driver neutrofilmigrationen och initierar inflammation.

IL-1β är en av signaturen gener som är förhöjd i primade neutrofiler ^22. I pIL1-dsRed reporter möss, dsRed fluorescenssignaler (dvs., Aktivering av IL-1β promotor) positivt korrelerar med IL-1β mRNA-expression och IL-1β proteinproduktion. <sup> 18 För att övervaka processen för neutrofila priming var en intravital mikroskopi metod som utvecklats som involverar induktion av hudinflammation med oxazolon (OX) i pIL1-DsRed musmodell efter in vivo märkning av neutrofiler med fluorescens-konjugerad anti-Ly6G mAb. Via denna modell, är det möjligt att studera beteende och funktion av stimulerade neutrofiler i djurmodeller av olika sjukdomar och störningar.

Protocol

Alla djurförsök utförs i enlighet med National Institutes of riktlinjer Hälsa och godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén vid University of Toledo. 1. Fenotypning av pIL1-DsRed Möss OBS: Offspring genereras genom avel heterozygota pIL1-DsRed-möss med vildtyp (WT) C57BL6 möss. Tre till fyra veckor gamla valpar anses redo för fenotypning. Submandibular blödning hos möss följer ett etablerat protokoll med mindre modifieringar …

Representative Results

Screening av pIL1-DsRed möss utförs baserat på den fenotypiska DsRed fluorescenssignalen producerad av deras perifera blodleukocyter med användning av flödescytometri. LPS-stimulering är känt för att inducera IL-1β produktion i myeloida celler inklusive neutrofiler, monocyter och dendritiska celler 26-28. Sålunda är isolerade leukocyter inkuberades med LPS för 4 h före flödescytometrianalys. Därefter grind inställd för att cirkulera myeloidceller baserade på …

Discussion

Syftet med denna studie är att utveckla en teknik för att övervaka processen för neutrofila priming i levande djur, som ännu inte uppfyllts av de för närvarande tillgängliga teknik. För att uppnå detta mål, är tre etablerade metoder utförs: 1) induktion av hudinflammation i IL-1 promotor-driven dsRed reporter möss som ett mått på priming, 2) in vivo märkning av neutrofiler med låga doser av fluorescens-konjugerad anti-Ly6G mAb, och 3) intravital konfokalmikroskopi avbildning. Kombinationen av …

Materials

Heparin sodium	APP Pharmaceuticals	NDC 63323-540-31
ACK lysing buffer	Lonza	10-548E
Fetal bovine serum	Sigma-Aldrich	F0926
Lipopolysaccharides	Sigma-Aldrich	L4391
Ketamine hydrochloride	Hospira	NDC 0409-2051-05
Xylazine	LLOYD Laboratory	NADA #139-236
Acepromazine	Boehringer Ingelheim	ANADA 200-361
Hair-removal cream	Church & Dwight
Acetone	Fisher Scientific	A16P4
Oxazolone	Sigma-Aldrich	E0753
Alexa Fluor 647 anti-mouse Ly6G antibody	BioLegend	127610
U-100 insulin syringe with 28 G needle	BD	329461
FITC-CM-Dextran, 150 Kda	Sigma-Aldrich	74817
Butterfly infusion set (27 G needle)	BD	387312
FACSCalibur cytometer	BD
CellQuest Pro software	BD
Confocal microscope	Olympus	FV1000
Metamorph Software	Universal Imaging