This manuscript describes a tube formation assay to quantify the effects of a given compound or condition on angiogenesis by using endothelial cell tube formation in a controlled environment.
Malignant tumors require a blood supply in order to survive and spread. These tumors obtain their needed blood from the patient’s blood stream by hijacking the process of angiogenesis, in which new blood vessels are formed from existing blood vessels. The CXCR2 (chemokine (C-X-C motif) receptor 2) receptor is a transmembrane G-protein-linked molecule found in many cells that is closely associated with angiogenesis1. Specific blockade of the CXCR2 receptor inhibits angiogenesis, as measured by several assays such as the endothelial tube formation assay. The tube formation assay is useful for studying angiogenesis because it is an excellent method of studying the effects that any given compound or environmental condition may have on angiogenesis. It is a simple and quick in vitro assay that generates quantifiable data and requires relatively few components. Unlike in vivo assays, it does not require animals and can be carried out in less than two days. This protocol describes a variation of the extracellular matrix supporting endothelial tube formation assay, which tests the CXCR2 receptor.
For at opnå de næringsstoffer er nødvendige for overlevelse, maligne tumorer kræver adgang til patientens blodbane. For at få denne adgang, tumorceller frigiver kemiske signaler, der stimulerer væksten af nye blodkar til svulsten, hvilket kapring den normale fysiologiske proces, der kaldes angiogenese 2. Det er også gennem blodkarrene skabt via angiogenese at metastase (dvs. spredning af kræft til andre organer) kan forekomme. Fordi processen med angiogenese er så afgørende for udviklingen af sådan en bred vifte af cancerformer, er det et attraktivt mål i anticancerterapi forskning 3.
En fremgangsmåde anvendes til at kvantificere angiogenese er at måle endothelial progenitor cellens evne til at danne rør når de anbringes på en ekstracellulær matrix. Fordi dannelsen af disse rør er et kritisk første skridt i angiogenese, prøvning miljøforhold (f.eks tilstedeværelse eller mangel på et givet compound), der kan stimulere eller inhibere kanaldannelse giver indsigt i specifikke trin, der kan målrettes til inhibering af angiogenese. Den endotelceller rør dannelse analysen er en af de mest udbredte 4 in vitro-metoder, der måler cellernes evne til at danne rør. Det er en enkel assay, der kræver relativt få komponenter og en kort dyrkningsperiode 5. Måske vigtigst, er imidlertid, at de data, der er opnået fra denne type assay er kvantificerbare.
Et eksempel på brugen af formationen rør assay involverer sammenligning af udvikling af rør fra vaskulære endotelceller dyrket på ekstracellulær matrix vs. vækstfaktor reduceres (GFR) ekstracellulære matrix. Den ekstracellulære matrix er en basalmembran-lignende materiale isoleret fra sarkom-celler og dets hovedkomponenter er laminin, type IV collagen, vækstfaktorer og proteoglycaner. Nogle forbindelser har forskellige virkninger på cellens evne til at danne rør når iet miljø med reducerede vækstfaktorer og reducerede heparansulfatproteoglycaner (HSPGs). HSPGs er en komponent af den ekstracellulære matrix, som signifikant reduceret i GFR ekstracellulære matrix. Som et eksempel, hvis den hypotese er, at angiogeneseinhibitorer, såsom SB225002, som blokerer CXCR2 receptor, har betydeligt svagere evne til at afbryde kanaldannelse når HSPGs er rigelige, så en sammenligning mellem formation rør aktivitet i ekstracellulær matrix og GFR ekstracellulær matrix er vigtigt at undersøge muligheden for angiogenese hæmning via kontrol af HSPGs.
Andre assays, som normalt bruges til at bestemme virkningerne af forbindelser på angiogenese er in vivo-metoder. Bemærkelsesværdige eksempler på dette er kyllingechorioallantoinmembranen (CAM) assay 6 under anvendelse hønseæg, og in vivo Matrigel plug angiogenese assay 7 under anvendelse mus. Mens in vivo metoder måler angiogenese i tEfter tre dimensioner og er mere repræsentative for den menneskelige krop sammenlignet med in vitro-dannelse assay lider de fejlen kræve betydeligt mere tid og er betydeligt vanskeligere at udføre. Både CAM-assayet og den ekstracellulære plug assayet tage mindst en uge 8 at gøre, mens i sammenligning kan dannelsen rør assayet gøres på en enkelt dag, og det kræver ikke brugen dyr.
Det er vigtigt at bemærke, at endothelceller anvendes i denne rapport er humane navlevene-endotelceller (HUVEC). Disse celler spiller en central rolle i vaskulær spire og vækst af blodkar, og er tilstrækkeligt analog til endotelceller i cancere, der skal anvendes til at vurdere anti-angiogenese aktivitet i både in vitro og in vivo forsøg 9. Andre celler, såsom primære mikrovaskulære endotelceller kan også anvendes.
Det er også vigtigt at bemærke, at ud over at have lavereniveauer af HSPGs har GFR ekstracellulære matrix også reducerede niveauer af mange komponenter sammenlignet med normale ekstracellulære matrix. Dette omfatter, men er ikke begrænset til: EGF, IGF-1, PDGF, og TGF-beta. Dem, der udfører eksperimenter studerer betydningen af disse forbindelser i forhold til angiogenese kan være interesseret i at bruge GFR ekstracellulære matrix.
Ved udførelse af dette assay er det vigtigt at holde den ekstracellulære matrix på is eller ved 4 ° C hele tiden medmindre andet er angivet. Hvis den ekstracellulære matrix opvarmes over 4 ° C, vil det polymerisere, og analysen vil blive ødelagt. Det er også vigtigt at sikre, at noget, der kommer i berøring (f.eks pipettespidser er pladen) med den ekstracellulære matrix er forafkølet til ovennævnte grund. Antallet af celler udsået i hver brønd er kritisk, vil for få celler ikke give den forventede bane i kontrolprøven, for mange celler vil danne store celleklynger eller et monolag, og assayet ikke gyldig. En anden vigtig faktor for succes i denne analyse er den celle passage nummer HUVEC'er. Passagen nummer skal altid være mindre end ti, ellers robust rør-dannelse kan ikke forekomme. Desuden bør man sørge for, at cellekulturmediet bruges ikke er udløbet, eller cellerne vil ikke være levedygtig. alternatlukkende, kan en aliquot mediet og dets komponenter og opbevar dem ved -20 ° C til bevaring i en tidsperiode efter udløbsdatoen. Selvfølgelig er det dog at foretrække at anvende medium før udløbsdatoen
Som alle procedurer, der er nogle ulemper ved at gennemføre den endotelcelle kanaldannelse assay. Et stort problem er, at, fordi der findes forskellige typer af endotelceller og bærermatrixer, kan resultaterne af assayet variere meget afhængigt af den anvendte type celle og matrix. De endotheliale celler, der anvendes (HUVEC'er, HAECs eller HMVECs) er primære celler, de er dyre at få og have variabilitet sammenlignet med immortaliserede celler. De primære celler har begrænsede passager til brug, og er derfor ikke egnet til langsigtede angiogenese eksperimenter 14. For pålidelige data, bør man altid bruge de samme typer for analysen. Som med andre in vitro-analyser, bør resultaterne af en formation rør assay være conbekræftet in vivo, fordi resultaterne fra de kontrollerede og kunstige betingelser for todimensional vævskultur ikke altid kan være afspejlet i den komplekse biosystemet af en levende organisme. Det er også vigtigt at huske på, at denne type assay kun kan anvendes til at påvise endotelcelle rør-dannelse, og bør ikke anvendes til at teste andre, ikke-endotel- rør dannende celler.
Dette assay er en ret simpel og hurtig metode til at kvantificere angiogene potentiale af en forbindelse. Det danner også en platform til yderligere forsøg, som alene, betyder det ikke give oplysninger om den særlige fremgangsmåde, hvorved forbindelsen faktisk rammer fartøjet formningsprocessen. Men brugen af varierede ekstracellulære matricer er et eksempel på, hvordan man yderligere skabe en ramme for forskning spørgsmål, som ikke er almindeligt anvendt. Der er fremgangsmåder til at undersøge specifikke biokemiske mekanismer af forbindelsen herunder specifikke inhibitorer, der er målrettet komponenter afangiogenese pathway. En anden fremgangsmåde kan være at ekstrahere RNA fra endotelcellerne og bruge RT-PCR (Real Time PCR) 12 til at analysere ændringer i genekspression, som kan forårsage væksten opførsel observeret i assayet. Fremtidige anvendelser af denne fremgangsmåde indbefatter transficeret HUVEC'er at skabe knock-down assays for specifikke trin i angiogenese pathway. Der er potentiale for at anvende denne metode til at studere lymfangiogenese vej. Ved at ændre de ekstracellulære matrixkomponenter, kan interaktionen mellem matrix og cellulær proces understøtter angiogenese i cancer blive yderligere belyst. Udvinding af RNA og proteiner fra endothelceller under disse særlige betingelser give yderligere kvantificerbare data svarende til billeddata.
The authors have nothing to disclose.
The work was funded by the Fund for Medical Research and Education, Wayne State University, Detroit, MI.
EGM-2 complete growth medium (EGM-2 bullet kit CC-3162 ) | Fisher | NC9525043 | HUVEC complete growth medium: EGM-2 base medium mixed with BBE (Bovine Brain Extract), hEGF (Human Epidermal Growth Factor), Hydrocortisone, GA-1000 (Gentamicin, Amphotericin-B), 2% FBS (Fetal Bovine Serum), VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor), hFGF-β (Human Fibroblast Growth Factor Beta), R3-IGF-1 (Long R Insulin-like Growth Factor One), Ascorbic Acid, and Heparin. Aliquot the medium and its components and store them at -20 oC, warm in 37 oC before use. |
MATRIGEL MATRIX 10ML Growth Factor Reduced (GFR); 10mL; LDEV-Free | Fisher | CB-40230 | Growth Factor Reduced (GFR) extracellular matrix, keep in -20 oC , warm in 4 °C before use. |
MATRIGEL MATRIX 10ML ; 10mL; LDEV-Free | Fisher | CB-40234 | extracellular matrix, keep in -20 oC, warm in 4 °C before use. |
SB225002 | Fisher | 559405 | CXCR2 inhibitor, keep in -20 oC, warm in room temperature before use. |
Primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) | ScienCell Research Laboratories | 8000 | culture it according reference 10. |
Trypsin 0.05%-EDTA phenol red | Invitrogen | 25300-054 | keep in 4 oC, warm in 37 oC before use. |
Nikon ECLIPSE Ti | Nikon | Inverted Research Microscope. | |
NIS-Elements AR 4.20.02 64 bit | Nikon | Inverted Research Microscope software | |
Graph-pad Prism 5 | GraphPad Software, Inc. | scientific 2D graphing and statistics software, to calculate IC50. |