Modelleren van myotone dystrofie 1 in C2C12 myoblastcellen
Summary
In dit protocol presenteren we de procedures vaststelling myotone dystrofie 1 myoblast modellen, waaronder geoptimaliseerde C2C12 celonderhoud, gen transfectie / transductie en myocyt differentiatie.
Abstract
Myotone dystrofie 1 (DM1) is een veel voorkomende vorm van spierdystrofie. Hoewel verschillende diermodellen vastgesteld voor DM1, myoblast cell modellen blijven belangrijk omdat ze een efficiënte cellulaire alternatief voor het bestuderen van cellulaire en moleculaire gebeurtenissen. Hoewel C2C12 myoblast cellen zijn op grote schaal gebruikt myogenesis, resistentie te bestuderen gen transfectie of virale transductie, belemmert onderzoek C2C12 cellen. We beschrijven hier een geoptimaliseerd protocol dat dagelijks onderhoud, transfectie en transductie procedures omvat om genen in C2C12-myoblasten en de inductie van differentiatie myocyten. Tezamen zijn deze procedures inschakelen beste transfectie / transductie efficiëntie en samenhangende differentiatie resultaten. Het protocol bij de vaststelling DM1 myoblasten celmodellen zou de studie van myotone dystrofie, evenals andere spierziekten profiteren beschreven.
Introduction
Myotone dystrofie (DM) is een autosomaal dominante ziekte die meerdere systemen, met name hart- en skeletspieren 1 beïnvloedt. Er zijn twee subtypen van deze ziekte, DM1 en DM2. DM1 is gebruikelijker en een ernstiger uiting dan DM2 2. De genetische mutatie onderliggende DM1 is een uitbreiding van CUG triplet repeats in het 3 'onvertaalde gebied (UTR) van DM proteïne kinase gen (DMPK) 3. De CUG aantal repeats in aangetaste individuen varieert van 5 tot 37. Daarentegen verhoogt tot meer dan 50 en soms wel duizenden in DM1 patiënten 4. Hierdoor RNA-bindende eiwitten, zoals muscleblind-like 1 (MBNL1), CUGBP en Elav-achtige familie 1 (Celf1), zijn misregulated. Door de opslag van de geëxpandeerde CUG herhalingen, verliest MBNL1 zijn vermogen om alternatieve splicing 5 reguleren. Celf1, anderzijds, wordt opwaarts gereguleerd 6,7. Overexpressie van Celf1 gaat gepaard met het verlies van spiermassaen zwakheid, die niet worden toegeschreven aan verlies van MBNL1 functie. Diermodellen simuleren DM1-gerelateerde veranderingen, waaronder DMPK 3'-UTR CUG expansie, verlies van MBNL1 en overexpressie van Celf1, zijn vastgesteld. Echter, modelleren DM1 in myoblasten biedt een efficiënt alternatief, vooral voor ontleden DM1-gerelateerde cellulaire en moleculaire gebeurtenissen.
C2C12 myoblasten-cellijn werd voor het eerst geïsoleerd uit gewond C3H muis spier en op grote schaal gebruikt om myogene differentiatie 8,9 bestuderen. C2C12 cellen sneller prolifereren in foetaal bovine serum (FBS) bevattende media en gemakkelijk differentiatie ondergaan wanneer FBS leeg. Maar met deze myoblast differentiatie model presenteert twee problemen: C2C12 cellen zijn vaak resistent tegen gentransfectie / virale transductie; en lichte variaties in cel handling en differentiatie procedure kan leiden tot duidelijke veranderingen in myotube formatie.
Ons laboratorium maakt gebruik van routinematig C2C12 myoblasten als acell model en heeft protocollen die effectief genen door plasmide transfectie, retrovirale transductie, en lentivirale transductie geven in C2C12 cellijn 10 ontwikkeld. In de video, tonen we de geoptimaliseerde procedures voor het transfecteren / transduceren C2C12 cellen en het behoud van differentiatie consistentie bij de vaststelling van DM1 myoblast modellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
C2C12 cellijn is gebruikt als een model om myogenesis 11-14 bestuderen. Deze cellen behouden een fibroblast-achtige look, prolifereren snel in media die 20% foetaal runderserum en gemakkelijk differentiëren in media die 2% paarden serum 15. De snelle groei en differentiatie zijn voordelige eigenschappen in een myogenesis cel model. Hier tonen we het gebruik van plasmide, retrovirale en lentivirale vectoren om cDNA, 3'-UTR en shRNA introduceren in C2C12-cellen. De kritische punten voor transfec…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Drs. Tom Cooper from the Baylor College of Medicine, Mani S. Mahadevan from the University of Wisconsin-Madison, and Didier Trono from the University of Geneva for reagents. This work is supported by a University of Houston startup fund (YL), American Heart Association grant (YL, 11SDG5260033), and the National Natural Science Foundation of China (XP, 81460047).
Materials
| DMEM, high glucose | Life Technologies | 11965-084 | for culture medium |
| Fetal Bovine Serum – Premium | Atlanta Biologicals | S11150 | for culture medium |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X) | Life Technologies | 10378-016 | for culture medium |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma Aldrich | I6634-100MG | for differentiation medium |
| equine serum | Atlanta Biologicals | S12150 | for differentiation medium |
| FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | for transfection |
| G418 sulfate | Gold Biotechnology | G-418-10 | for drug resistant selection |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma Aldrich | sc-108071 | for drug resistant selection |
| NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15 well | Life Technologies | NP0323BOX | for western blot |
| NuPAGE Transfer Buffer (20X) | Life Technologies | NP00061 | for western blot |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer (20X) | Life Technologies | NP0002 | for western blot |
| Amersham Protran Supported 0.2 NC, 300mmx4m | GE healthcare life science | 10600015 | for western blot |
| MF 20 | Developmental Hybridoma Bank | MF 20 | primary Ab for immunostaining |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Texas Red-X conjugate | Thermo Fisher Scientific | T-862 | secondary Ab for immunostaining |
| One step qRT-PCR MasterMix | AnaSpec | 05-QPRT-032X | for qRT-PCR |
| TriPure Isolation Reagent | Roche | 11667165001 | for RNA isolation |
| CUG-BP1 Antibody (3B1) | santa cruz | sc-20003 | primary Ab western blot |
| Actin Antibody | santa cruz | sc-1615 | goat polyclonal IgG for loading control |
| 293T Ecopack | Clontech | 631507 | cells for retrovirus preparation |
| pMSCV-puro | Clontech | 634401 | empty retroviral vector for retrovirus preparation |
| pMSCV-Celf1Flag-puro | house-constructed | not available | retroviral vector encoding Celf1Flag, used in retrovirus preparation |
| psPAX2 | gift from Didier Trono | not available | for lentivirus preparation |
| pMD2.G | gift from Didier Trono | not available | for lentivirus preparation |
| GFP-CUG5 | gift from M.S. Mahadevan | not available | details in reference 10 |
| GFP- CUG200 | gift from M.S. Mahadevan | not available | details in reference 10 |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | for immunostaining |
| paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | for immunostaining |
| TWEEN 20 | Sigma Aldrich | P9416 | for immunostaining |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | for immunostaining |
Riferimenti
- Harper, P. S. . Myotonic dystrophy. 3rd edn. , (2001).
- Timchenko, L. Molecular mechanisms of muscle atrophy in myotonic dystrophies. Int J Biochem Cell Biol. 45 (10), 2280-2287 (2013).
- Brook, J. D., et al. Molecular basis of myotonic dystrophy: expansion of a trinucleotide (CTG) repeat at the 3′ end of a transcript encoding a protein kinase family member. Cell. 68 (4), 799-808 (1992).
- Chau, A., Kalsotra, A. Developmental insights into the pathology of and therapeutic strategies for DM1: Back to the basics. Dev Dyn. 244 (3), 377-390 (2015).
- Ho, T. H., et al. Muscleblind proteins regulate alternative splicing. EMBO J. 23 (15), 3103-3112 (2004).
- Kuyumcu-Martinez, N. M., Wang, G. S., Cooper, T. A. Increased steady-state levels of CUGBP1 in myotonic dystrophy 1 are due to PKC-mediated hyperphosphorylation. Mol Cell. 28 (1), 68-78 (2007).
- Kalsotra, A., et al. The Mef2 transcription network is disrupted in myotonic dystrophy heart tissue, dramatically altering miRNA and mRNA expression. Cell Rep. 6 (2), 336-345 (2014).
- Yaffe, D., Saxel, O. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature. 270 (5639), 725-727 (1977).
- Blau, H. M., Chiu, C. P., Webster, C. Cytoplasmic activation of human nuclear genes in stable heterocaryons. Cell. 32 (4), 1171-1180 (1983).
- Peng, X., et al. Celf1 regulates cell cycle and is partially responsible for defective myoblast differentiation in myotonic dystrophy RNA toxicity. Biochim Biophys Acta. 1852 (7), 1490-1497 (2015).
- Amack, J. D., Mahadevan, M. S. The myotonic dystrophy expanded CUG repeat tract is necessary but not sufficient to disrupt C2C12 myoblast differentiation. Hum Mol Genet. 10 (18), 1879-1887 (2001).
- Amack, J. D., Paguio, A. P., Mahadevan, M. S. Cis and trans effects of the myotonic dystrophy (DM) mutation in a cell culture model. Hum Mol Genet. 8 (11), 1975-1984 (1999).
- Bhagavati, S., Shafiq, S. A., Xu, W. (CTG)n repeats markedly inhibit differentiation of the C2C12 myoblast cell line: implications for congenital myotonic dystrophy. Biochim Biophys Acta. 1453 (2), 221-229 (1999).
- Amack, J. D., Mahadevan, M. S. Myogenic defects in myotonic dystrophy. Dev Biol. 265 (2), 294-301 (2004).
- Emerson, C. P., Sweeney, H. L. . Methods in muscle biology. 52, (1997).
- Ward, A. J., Rimer, M., Killian, J. M., Dowling, J. J., Cooper, T. A. CUGBP1 overexpression in mouse skeletal muscle reproduces features of myotonic dystrophy type 1. Hum Mol Genet. 19 (18), 3614-3622 (2010).
- Koshelev, M., Sarma, S., Price, R. E., Wehrens, X. H. T., Cooper, T. A. Heart-specific overexpression of CUGBP1 reproduces functional and molecular abnormalities of myotonic dystrophy type 1. Hum Mol Genet. 19 (6), 1066-1075 (2010).
