In diesem Protokoll stellen wir die Verfahren in Muskeldystrophie 1 Myoblasten Modelle Gründung, einschließlich optimierte C2C12 Zell Wartung, Gen-Transfektion / Transduktion und Myozyten-Differenzierung.
Muskeldystrophie 1 (DM1) ist eine häufige Form der Muskeldystrophie. Obwohl mehrere Tiermodelle haben für DM1, Myoblasten Zellmodelle sind nach wie vor wichtig, weil sie eine effiziente zelluläre Alternative für die Untersuchung zellulärer und molekularer Ereignisse bieten etabliert. Obwohl in großem Umfang Zellen C2C12 Myoblasten verwendet myogenesis, Resistenz gegen Gen-Transfektion oder virale Transduktion zu studieren, behindert die Forschung in C2C12-Zellen. Hier beschreiben wir ein optimiertes Protokoll, das die tägliche Wartung umfasst, Transfektion und Transduktion Verfahren Gene in C2C12 Myoblasten und die Induktion von myocyte Differenzierung einzuführen. Gemeinsam ermöglichen diese Verfahren am besten Transfektion / Transduktionseffizienzen sowie konsequente Differenzierung Ergebnisse. Das Protokoll bei der Einrichtung DM1 Myoblasten Zellmodelle beschrieben würde die Studie von Muskeldystrophie zugute kommen, sowie andere Muskelerkrankungen.
Muskeldystrophie (DM) ist eine autosomal dominante Erkrankung , die mehrere Systeme betrifft, vor allem Herz- und Skelettmuskulatur 1. Es gibt zwei Subtypen dieser Krankheit, DM1 und DM2. DM1 ist häufiger und hat 2 eine schwere Manifestation als DM2. Die genetische Mutation DM1 zugrunde liegt , ist eine Erweiterung der CUG Triplett – Wiederholungen in der 3' – untranslatierten Region liegt (UTR) von DM – Proteinkinase – Gen (DMPK) 3. Der CUG Wiederholungszahl in nicht betroffenen Individuen variiert von 5 bis 37. Im Gegensatz dazu erhöht sich auf mehr als 50, und manchmal bis zu Tausenden in DM1 Patienten 4. Als Ergebnis RNA-bindende Proteine, wie muscle-like 1 (MBNL1), CUGBP und Elav-like Familie 1 (Celf1) falsch reguliert sind. Aufgrund der Sequestrierung auf den CUG repeats erweitert, verliert seine Fähigkeit MBNL1 5 alternatives Spleißen zu regulieren. Celf1, andererseits wird 6,7 hochreguliert. Die Überexpression von Celf1 mit Muskelverlust verbundenund Schwäche, die zum Verlust nicht von MBNL1 Funktion zugeschrieben werden. Tiermodelle DM1 bedingte Veränderungen Simulieren, einschließlich DMPK 3'-UTR CUG Expansion, Verlust von MBNL1 und Überexpression von Celf1, festgelegt wurden. Allerdings bietet die Modellierung DM1 in Myoblasten eine effiziente Alternative, vor allem für Sezieren DM1 bezogenen zellulären und molekularen Ereignisse.
C2C12 Myoblasten – Zelllinie wurde zum ersten Mal von verletzten C3H Maus Muskel isoliert und weit verbreitete Muskeldifferenzierung 8,9 zu studieren. C2C12 Zellen vermehren sich rasch in fötalem Rinderserum (FBS) Medien -haltigen und leicht Differenzierung durchmachen, wenn FBS erschöpft ist. Doch dieses Myoblastendifferenzierung Modell stellt zwei Herausforderungen: C2C12-Zellen sind oft resistent gegen Gen-Transfektion / Virusübertragung; und leichte Variationen in die Handhabung von Zellen und Differenzierungsverfahren kann zu deutlichen Veränderungen in Myotube Bildung führen.
Unser Labor routinemäßig verwendet C2C12 Myoblasten als acell – Modell und hat Protokolle entwickelt , die effektiv Gene durch Plasmidtransfektion 10, retrovirale Transduktion und lentivirale Transduktion in C2C12 – Zelllinie zu liefern. Im Video zeigen wir die optimierte Verfahren für die Transfektion / Transduktion C2C12-Zellen und die Differenzierung Konsistenz beibehalten in Modellen DM1 Myoblasten zu etablieren.
C2C12 – Zelllinie wurde als Modell verwendet worden myogenesis 11-14 zu studieren. Diese Zellen behalten einen Fibroblasten-ähnliche Aussehen, proliferieren schnell in den Medien 20% fötales Rinderserum enthält , und unterscheiden sich leicht in Medien mit 2% Pferdeserum 15. Das schnelle Wachstum und die Differenzierung sind vorteilhafte Eigenschaften in einem myogenesis Zellmodell. Hier zeigen wir die Verwendung des Plasmids, retroviralen und lentiviralen Vektoren einzuführen cDNA, 3'-UTR …
The authors have nothing to disclose.
We thank Drs. Tom Cooper from the Baylor College of Medicine, Mani S. Mahadevan from the University of Wisconsin-Madison, and Didier Trono from the University of Geneva for reagents. This work is supported by a University of Houston startup fund (YL), American Heart Association grant (YL, 11SDG5260033), and the National Natural Science Foundation of China (XP, 81460047).
DMEM, high glucose | Life Technologies | 11965-084 | for culture medium |
Fetal Bovine Serum – Premium | Atlanta Biologicals | S11150 | for culture medium |
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X) | Life Technologies | 10378-016 | for culture medium |
Insulin from bovine pancreas | Sigma Aldrich | I6634-100MG | for differentiation medium |
equine serum | Atlanta Biologicals | S12150 | for differentiation medium |
FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | for transfection |
G418 sulfate | Gold Biotechnology | G-418-10 | for drug resistant selection |
Puromycin dihydrochloride | Sigma Aldrich | sc-108071 | for drug resistant selection |
NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15 well | Life Technologies | NP0323BOX | for western blot |
NuPAGE Transfer Buffer (20X) | Life Technologies | NP00061 | for western blot |
NuPAGE MES SDS Running Buffer (20X) | Life Technologies | NP0002 | for western blot |
Amersham Protran Supported 0.2 NC, 300mmx4m | GE healthcare life science | 10600015 | for western blot |
MF 20 | Developmental Hybridoma Bank | MF 20 | primary Ab for immunostaining |
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Texas Red-X conjugate | Thermo Fisher Scientific | T-862 | secondary Ab for immunostaining |
One step qRT-PCR MasterMix | AnaSpec | 05-QPRT-032X | for qRT-PCR |
TriPure Isolation Reagent | Roche | 11667165001 | for RNA isolation |
CUG-BP1 Antibody (3B1) | santa cruz | sc-20003 | primary Ab western blot |
Actin Antibody | santa cruz | sc-1615 | goat polyclonal IgG for loading control |
293T Ecopack | Clontech | 631507 | cells for retrovirus preparation |
pMSCV-puro | Clontech | 634401 | empty retroviral vector for retrovirus preparation |
pMSCV-Celf1Flag-puro | house-constructed | not available | retroviral vector encoding Celf1Flag, used in retrovirus preparation |
psPAX2 | gift from Didier Trono | not available | for lentivirus preparation |
pMD2.G | gift from Didier Trono | not available | for lentivirus preparation |
GFP-CUG5 | gift from M.S. Mahadevan | not available | details in reference 10 |
GFP- CUG200 | gift from M.S. Mahadevan | not available | details in reference 10 |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | for immunostaining |
paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | for immunostaining |
TWEEN 20 | Sigma Aldrich | P9416 | for immunostaining |
DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | for immunostaining |