Screening per Funzionale non codificante Varianti genetiche Utilizzando Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) e DNA-affinità precipitazioni Assay (DAPA)

Summary

We present a strategic plan and protocol for identifying non-coding genetic variants affecting transcription factor (TF) DNA binding. A detailed experimental protocol is provided for electrophoretic mobility shift assay (EMSA) and DNA affinity precipitation assay (DAPA) analysis of genotype-dependent TF DNA binding.

Abstract

Population and family-based genetic studies typically result in the identification of genetic variants that are statistically associated with a clinical disease or phenotype. For many diseases and traits, most variants are non-coding, and are thus likely to act by impacting subtle, comparatively hard to predict mechanisms controlling gene expression. Here, we describe a general strategic approach to prioritize non-coding variants, and screen them for their function. This approach involves computational prioritization using functional genomic databases followed by experimental analysis of differential binding of transcription factors (TFs) to risk and non-risk alleles. For both electrophoretic mobility shift assay (EMSA) and DNA affinity precipitation assay (DAPA) analysis of genetic variants, a synthetic DNA oligonucleotide (oligo) is used to identify factors in the nuclear lysate of disease or phenotype-relevant cells. For EMSA, the oligonucleotides with or without bound nuclear factors (often TFs) are analyzed by non-denaturing electrophoresis on a tris-borate-EDTA (TBE) polyacrylamide gel. For DAPA, the oligonucleotides are bound to a magnetic column and the nuclear factors that specifically bind the DNA sequence are eluted and analyzed through mass spectrometry or with a reducing sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) followed by Western blot analysis. This general approach can be widely used to study the function of non-coding genetic variants associated with any disease, trait, or phenotype.

Introduction

Sequencing e studi di genotipizzazione basato, compresi gli studi Genome-Wide Association (GWAS), studi locus candidato, e profondo-sequenziamento studi, hanno identificato molte varianti genetiche che sono statisticamente associati con una malattia, caratteristica, o fenotipo. Contrariamente alle previsioni iniziali, la maggior parte di queste varianti (85-93%) si trovano in regioni non codificanti e non cambiano la sequenza di amminoacidi delle proteine ^​​1,2. Interpretando la funzione di queste varianti non codificanti e determinare i meccanismi biologici che li collegano alla malattia associata, tratto, o fenotipo è dimostrato impegnativo ^3-6. Abbiamo sviluppato una strategia generale di identificare i meccanismi molecolari che collegano le varianti di un importante fenotipo intermedio – l'espressione genica. Questo gasdotto è specificamente progettato per identificare la modulazione di legare da varianti genetiche TF. Questa strategia combina approcci computazionali e tecniche di biologia molecolare finalizzate a prevedereeffetti biologici delle varianti candidati in silico e verificare empiricamente queste previsioni (Figura 1).

Figura 1:.. Approccio strategico per l'analisi dei passaggi non codificanti varianti genetiche che non sono inclusi nel protocollo dettagliato associato a questo manoscritto sono di colore grigio Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

In molti casi, è importante iniziare ampliare l'elenco delle varianti di includere tutti quelli in alta linkage disequilibrium (LD) con ciascuna variante statisticamente associato. LD è una misura di associazione non casuale di alleli in due differenti posizioni cromosomiche, che può essere misurata dal r ² statistica ^7. r ² è una misura del linKage squilibrio fra due varianti, con una R ² = 1 denota perfetto collegamento tra due varianti. Alleli in alta LD si trovano a co-separare sul cromosoma attraverso popolazioni ancestrali. array di genotipizzazione attuali non includono tutte le varianti conosciute nel genoma umano. Invece, sfruttano il LD all'interno del genoma umano e comprendono un sottoinsieme delle varianti note che agiscono come proxy per altre varianti di una particolare regione del LD ^8. Così, una variante senza alcuna conseguenza biologica può essere associato ad una particolare malattia perché è in LD con causale variant-variante con un effetto biologico significativo. Procedurale, si consiglia di convertire l'ultima versione dei 1.000 genomi Project ⁹ file di chiamata variante (VCF) in file binari compatibili con PLINK ^10,11, uno strumento open-source per l'intera analisi di associazione genoma. In seguito, tutte le altre varianti genetiche con LD r ^2> 0.8 con ogni ingresso va geneticariant può essere identificato come candidati. E 'importante usare la popolazione di riferimento appropriato per questo passo- esempio, se una variante è stato identificato nei soggetti di origine europea, i dati provenienti da soggetti di origini simili dovrebbero essere utilizzati per l'espansione LD.

espansione LD si traduce spesso in decine di varianti candidati, ed è probabile che solo una piccola frazione di queste contribuiscono alla malattia meccanismo. Spesso, è praticamente impossibile esaminare sperimentalmente ciascuna di queste varianti singolarmente. E 'quindi utile per sfruttare le migliaia di pubblicamente disponibili i set di dati di genomica funzionale come filtro per dare priorità alle varianti. Ad esempio, il consorzio ENCODE ¹² ha eseguito migliaia di esperimenti di ChIP-Seq che descrivono il legame del TF e co-fattori, e segni istoni in una vasta gamma di contesti, insieme ai dati della cromatina di accessibilità da tecnologie come DNasi-ss ^13, ATAC -seq ^14, e FAIRE-ss ^15. databAsi e server web, come il browser UCSC Genome ^16, tabella di marcia Epigenomics ^17, Blueprint Epigenome ^18, Cistrome ^19, e Remap ²⁰ fornire libero accesso ai dati prodotti da questi e altre tecniche sperimentali in una vasta gamma di tipi e condizioni di cellule. Quando ci sono troppe varianti per esaminare sperimentalmente, questi dati possono essere utilizzati per dare la priorità quelli situati all'interno probabili regioni regolatorie in materia tipi di cellule e tessuti. Inoltre, nei casi in cui una variante è all'interno di un picco ChIP-seq per una proteina specifica, questi dati possono fornire cavi potenziali per il TF specifico (s) o cofattori cui legame potrebbe essere che interessano.

Successivamente, le varianti risultanti priorità sono proiettati sperimentale per validare proteina genotipo-dipendente predetto legame con EMSA ^21,22. EMSA misura la variazione della migrazione del oligo su un gel TBE non riducente. oligo fluorescente è incubato con illisato nucleare e legame di fattori nucleari ritardare il movimento del oligo sul gel. In questo modo, oligo che ha legato più fattori nucleari presenterà come un segnale fluorescente forte alla scansione. In particolare, l'EMSA non richiede previsioni circa le proteine ​​specifiche il cui legame saranno interessati.

Una volta che le varianti sono identificati che si trovano all'interno di regioni regolatorie previsti e sono in grado di fattori nucleari differenziale vincolanti, metodi computazionali sono impiegati per predire il TF specifico (s), il cui legame che potrebbero influenzare. Noi preferiamo usare CIS-BP ^23,24, RegulomeDB ^25, UNIProbe ^26, e JASPAR ^27. Una volta che il candidato TF sono identificate, queste previsioni possono essere specificamente testati utilizzando anticorpi contro questi TF (EMSA-supershifts e DAPA-western). Un EMSA-supershift comporta l'aggiunta di un anticorpo specifico TF al lisato nucleare e oligo. Un risultato positivo in un EMSA-supershift è represented come un ulteriore spostamento nella banda EMSA, o una perdita di banda (valutata in riferimento ^28). Nel DAPA complementare, un duplex oligo 5'-biotinilato contenente la variante e il 20 paia di basi di accompagnamento nucleotidi sono incubati con lisato nucleare dal tipo di cellula in questione (s) per catturare eventuali fattori nucleari legame specifico gli oligonucleotidi. Il complesso fattore duplex-nucleare oligo è immobilizzato dalla streptavidina microsfere in una colonna magnetica. I fattori nucleari legati vengono raccolti direttamente tramite eluizione ^29,48. previsioni vincolanti possono poi essere valutati da un Western blot utilizzando anticorpi specifici per la proteina. Nei casi in cui non ci sono previsioni evidenti, o anche molte previsioni, i eluizioni dalla variante di pull-down degli esperimenti DAPA possono essere inviati a un nucleo di proteomica per identificare TF candidati mediante spettrometria di massa, che possono in seguito essere convalidati utilizzando questi precedentemente descritte metodi.

Nel resto della articlE, viene fornito il protocollo dettagliato per EMSA e DAPA analisi delle varianti genetiche.

Protocol

1. preparazione di soluzioni e reagenti Ordinare sonde oligonucleotidiche DNA personalizzati per l'utilizzo in EMSA e DAPA. Per ridurre la proteina non specifica vincolante, progettare oligos brevi (tra i 35-45 coppie di basi (bp) di lunghezza) 30, e inserire la variante di interesse direttamente al centro affiancato da suo 17 bp endogena sequenza genomica. Per oligo EMSA, aggiungere un 'fluoroforo 5. Per oligo DAPA, aggiungere un tag 5 'biotina. Ordinare sia il filam…

Representative Results

In questa sezione, i risultati rappresentativi di cosa aspettarsi sono forniti durante l'esecuzione di un EMSA o DAPA, e la variabilità per quanto riguarda la qualità del lisato è caratterizzata. Ad esempio, è stato suggerito che il congelamento e scongelamento campioni proteici più volte può causare denaturazione. Al fine di esplorare la riproducibilità delle analisi EMSA nel contesto di questi cicli "gelo-disgelo", due 35 oligo bp diverse in una sola variante genet…

Discussion

Nonostante i progressi nelle tecnologie di sequenziamento e genotipizzazione hanno notevolmente migliorato la nostra capacità di individuare le varianti genetiche associate alla malattia, la nostra capacità di comprendere i meccanismi funzionali colpite da queste varianti è in ritardo. Una fonte importante del problema è che molte varianti associate alla malattia sono situati in n on-regioni codificanti del genoma, che probabilmente incidere più difficile da prevedere meccanismi che controllano l'espressi…

Materials

Custom DNA Oligonucleotides	Integrated DNA Technologies		http://www.idtdna.com/site/order/oligoentry
Potassium Chloride	Fisher Scientific	BP366-500	KCl, for CE buffer
HEPES (1M)	Fisher Scientific	15630-080	For CE and NE buffer
EDTA (0.5M), pH 8.0	Life Technologies	R1021	For CE, NE, and annealing buffer
Sodium Chloride	Fisher Scientific	BP358-1	NaCl, for NE buffer
Tris-HCl (1M), pH 8.0	Invitrogen	BP1756-100	For annealing buffer
Phosphate Buffered Saline (1X)	Fisher Scientific	MT21040CM	PBS, for cell wash
DL-Dithiothreitol solution (1M)	Sigma	646563	Reducing agent
PMSF	Thermo Scientific	36978	Protease Inhibitor
Phosphatase Inhibitor Cocktail	Thermo Scientific	78420	Prevents dephosphorylation of TFs
Nonidet P-40 Substitute	IBI Scientific	IB01140	NP-40, for nuclear extraction
BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225	For measuring protein concentration
Odyssey EMSA Buffer Kit	Licor	829-07910	Contains all necessary EMSA buffers
TBE Gels, 6%, 12 Wells	Invitrogen	EC6265BOX	For EMSA
TBE Buffer (10X)	Thermo Scientific	B52	For EMSA
FactorFinder Starting Kit	Miltenyi Biotec	130-092-318	Contains all necessary DAPA buffers
Licor Odyssey CLx	Licor		Recommended scanner for DAPA/EMSA
Antibiotic-Antimycotic	Gibco	15240-062	Contains 10,000 units/mL of penicillin, 10,000 µg/mL of streptomycin, and 25 µg/mL of Fungizone® Antimycotic
Fetal Bovine Serum	Gibco	26140-079	FBS, for culture media
RPMI 1640 Medium	Gibco	22400-071	Contains L-glutamine and 25mM HEPES